Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Bu iletişim kuralı şekil 1 ‘ de özetlenen ve gDNA, sindirim enzimleri hidrolize alkali ile tedavi ribonucleotides, sayısı quantitate edebilmek için ile yalıtım içerir gDNA, 5´-OH ücretsiz biter fosforilasyon, ssDNA ligasyonu bağdaştırıcıları, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme sıralama önce içine dahil ribonucleotides fosfodiester bağları. 1. bağdaştırıcıları ve dizin astar elde ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, bağdaştırıcı ve ARC78-ARC107 dizin Astar boyaları (bkz. Tablo 1). Not: Oligonucleotides HPLC saf olmalıdır. ARC76/77 dubleks sipariş. Hazırlamak 100 µM hisse senedi çözümler her Oligonükleotid Tris-EDTA (TE) arabelleği (Tablo reçetesi görmek) ve depolamak -20 ° C. ARC67/77 10 µM çözümleri ve 2 µM çözümleri ARC49 ve dizin astar, elüsyon arabellekte (EB; bkz: Malzemeler tablo) sulandrarak hazırlayın. Mağaza-20 ° C’de 2. Büyüme ve hücre hasat büyümek HeLa hücreleri 70 ML Dulbecco ' s modifiye kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum 250 mL Spinner şişesi 37 olarak takıma ° C. Hücreleri saymak ve 5 x 10 6 hücreler bir 50 mL tüp, santrifüj, 200 x g, 5 min için toplamak ve süpernatant atın. 20 mL 1 x PBS, santrifüj, 200 x g, 5 min için hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın. Granül-20 ° C’de dondurmak veya DNA arıtma ile devam. 3. DNA arıtma ve Nefelometri gDNA fenol kloroform ayıklama aşağıda açıklandığı gibi kullanarak arındırmak. Resuspend 2 mL lizis arabellek hücrelerde (Tablo reçetesi görmek) ve Isıtma blokta 42 ° C’de 30 dk için kuluçkaya. Dikkat: Lizis arabellek tehlikeli bileşenleri içerir. SDS çözüm rahatsız edici, İndinavir K duyarlılığı, rahatsız edici ve zehirli. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek. İki 2 mL tüpler örnekte bölünmüş ve 1 birim (V) fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) eklemek. Uyarı: Toksik, mutajenik, aşındırıcı ve su ortamları için tehlikeli fenol kloroform izoamil alkol. Kullanmak bir duman başlık, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve özel fenol kloroform israf içinde atmak. Mix inversiyon için 30-60 s ve santrifüj 15.000 x 5 min için g oda sıcaklığında. Not: hangi sonuçları deforme rastgele kırılmalara, tanıtımı önlemek için DNA girdap mı. 1 V fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve yeni bir 2 mL tüp üst, sulu faz transfer. Mix inversiyon ve 15.000 x g 4 de 5 dk santrifüj ° C. Yeni bir 2 mL tüp ve 20 µL eklemek için üst, sulu faz transfer NaCl (5 M) ve 1 V / soğuk isopropanol. Dikkat: Yanıcı, rahatsız edici ve zehirli Isopropanol. Havalandırılmış bir dolapta saklamak, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam. Mix INVERSION tarafından ve en az 1 h -20 için kuluçkaya ° C. İçin 15.000 x g, 4 ° C ve atma süpernatant, 20 dk santrifüj. Yıkama DNA Pelet 200 µL soğuk % 70 etanol ile 15.000 x g 4 ° c de 20 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Dikkat: % 70 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Çalışma çözüm-20 ° C, başka türlü mağaza havalandırılmış kabine, aşınma koruyucu giysiler ve eldiven tutmak ve ateş kaynaklarını hiçbir devam. 20-25 dakika süreyle oda sıcaklığında DNA Pelet Makinası Erimesi DNA parçaları 100 µL te tampon ve bir tüp örneklerinde havuz. Quantitate DNA toplama dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak ' s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi). Not: çünkü spektrofotometrik DNA Nefelometri artık fenol tarafından etkilenebilir dsDNA Nefelometri reaktif kullanın. Mağaza DNA-20 ° c veya HincII tedavi ile devam. 4. HincII tedavi ve alkali hidroliz bir tepki olarak DNA’ın Özet 1 µg karışımı 5 µL 10 x arabellek 3.1, 1 µL (10 U) içeren HincII ve nükleaz ücretsiz H 2 O son hacmiyle 50 µL. Not: tüp ligasyonu için en uygun koşulları elde etmek için ikinci strand sentez ve PCR güçlendirme, bu DNA’yı ribonucleotides çok düşük bir dizi içerir beklenen giriş DNA miktarını artırmak gerekli olabilir. Benzer şekilde, ribonucleotides sayısı çok yüksek ise giriş DNA azaltmak gerekli olabilir. 37 ° C’de 30 dk için kuluçkaya HincII arındırmak tedavi DNA ile paramagnetic boncuk. Not: kapakları granül tüpler açarak değil rahatsız etmek için aşağıdaki adımları açmak tüp tutun. Ekleyin 1.8 V paramagnetic boncuk her örnek, dikkatle pipetting tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya Boncuk 5 min için cips daha sonra kaldırmak ve süpernatant atmak için manyetik bir raf kullanın. Yaklaşık 30 s sonra Kaldır ve atma süpernatant için 150 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) ile Pelet yıkayın. Yıkama Pelet ile 200 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) yaklaşık 30 s sonra kaldırmak ve süpernatant atın. Not: Artık etanol 10 µL pipet ile kaldırılabilir. Damlacıkları spun aşağı kısaca önceden. Kuru, oda sıcaklığında yaklaşık 15-20 dakika süreyle örnekleri Not: Tam olarak ne zaman boncuk hacmi ve Pelet şeklinde bağlıdır, bu nedenle granül görsel olarak kontrol edilmelidir. Manyetik raf tüpler kaldırın ve Pelet 45 µL EB, tarafından dikkatle pipetting mix elute. 5 dk sonra manyetik raf üstündeki cips ve saf DNA’ın 45 µL 4.4 adımda kullanmak için kuluçkaya. Ekleyin 5 µL KOH (3 M) veya KCl (3 M) toplam hacmi 50 µL oluşturma DNA için. Dikkat: 3 M KOH aşındırıcı bir çözümdür. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek. Incubate bir hibridizasyon 55 ° C’de 2 h için fırın buz üzerinde 5 min tarafından takip Not: Tüp Tekdüzen bir Isıtma korumak ve kapağı, yoğunlaşma önlemek bir Isıtma blok yerine bir fırın KOH tedavi gerçekleştirmek için önerilir. 10 µL sodyum asetat ekleyerek çökelti DNA (3 M, pH = 5,2) ve 125 µL soğuk % 100 etanol. 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya Dikkat: % 100 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Saklamak havalandırılmış bir dolapta, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam. Cips gDNA 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de centrifuging tarafından ve süpernatant atın. Yıkama DNA Pelet 250 µL soğuk % 70 alkol, santrifüj kapasitesi 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de ve süpernatant atın. Not: damlacıkları çıkarmak, tüp aşağı kısaca tekrar döndü ve süpernatant kaldırılabilir 10 µl pipet ile. Yaklaşık 5-10 dakika için açık bir tüp içinde görünür herhangi bir sıvı buharlaşıp vardır kadar kuru Pelet izin. İzin DNA Pelet erime 20 µL EB, oda sıcaklığında 30 dakika içinde. 5. 5´ son fosforilasyon her örnek önceden eksilerini için tepki karışımı hazırlayın2.5 µL 10 x T4 polinükleotit kinaz tepki arabellek, 1 µL (10 U) 3´ fosfataz eksi T4 polinükleotit kinaz ve 2.5 µL ATP (10 mM) isting. Transfer 19 µL her DNA’ın örnek bir yeni 200 µL tüp içine ve termo cycler 85 ° C’de 3 min için denatüre. Serin DNA örnekleri buzda ve her örnek için 6 µL tepki Mix ekleyin. 30 dk ve stop örnekleri 20 dk. 65 ° C’de kuluçka tarafından tepki için 37 ° C’de Incubate reaksiyon karışımları Arındırmak DNA olarak açıklanan 4,3, 1.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ama 14 µL EB elute. 6. ssDNA tüp ligasyonu önceden 0.5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligaz tepki arabellek, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), oluşan her örnek için tepki karışımı hazırlayın 0.5 µL ARC140 (100 µM) ve 50 µL 8000 PEG. De pipetting tarafından Mix. Dikkat: CoCl 3 (NH 3) 6 kanserojen, duyarlılığı ve su ortamında için tehlikeli olduğunu. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek. Transfer 13 µL saf DNA’ın yeni bir 200 µL tüp 5.5 adım ve termo cycler 85 ° C’de 3 min için denatüre. Buz üzerinde DNA serin ve 36 µL pipetting tarafından mix, her örnek için tepki karışımı ekleyin ve spin aşağı kısaca. Her tepki için eklemek 1 µL (10 U) T4 RNA ligaz, mix pipetting tarafından ve spin aşağı kısaca. Örnekleri, oda sıcaklığında karanlık geceleme kuluçkaya. 7. İkinci-strand sentez arındırmak bakmaksızın DNA 4,3, açıklandığı gibi ama 0.8 V paramagnetic boncuk kullanın, boncuk 10 min için cips ve 20 µL EB elute. Not: ilk Pelet adım nedeniyle daha yüksek viskozite ligasyonu tepki karışımı uzun. DNA örneği yeni 200 µL PCR Tube transfer 20 µL. 0.8 V paramagnetic boncuk üretici takip kullanarak arıtma adımı yineleyin ' s özellikleri ve 14 µL EB elute. Reaksiyon karışımı önceden 10 x T7 DNA polimeraz tepki arabellek, 2 µL 2 µL oluşan her örnek için hazırlamak ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) ve 0.8 µL BSA (1 mg/mL). Transfer 12,8 µL saf DNA bir yeni 200 µL tüp, termo cycler 85 ° C’de 3 min için denatüre. Buz üzerinde DNA serin ve her örnek, pipetting tarafından mix, spin aşağı kısaca ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya tepki karışımı 6.8 µL eklemek. 0.4 µL (4 U) T7 DNA polimeraz her tepki ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Arındırmak DNA olarak 4,3, açıklanan 0.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ve 11 µL EB elute. 8. PCR güçlendirme ve Kütüphane Nefelometri hazırla yeni 200 her örnek için tepki karışımı µL tüp peşin 7.5 µL oluşan ARC49 (2 µM), 7.5 µL dizin astar (2 µM, her örnek için benzersiz) ve sıcak başlangıç x 25 µL 2 hazır karışım. Ekleyin 10 µL her tepki için DNA örneği. Aşağıdaki koşullar kullanarak kütüphane yükseltmek: 45 için 95 ° C’de denatüre 18 98 ° C devredir 15 ardından s, s, 30 65 ° C s, 30 72 ° C s, 72 ° C 2 dk. tutun örnekleri 4 ° için son bir uzama ile biten C amplifikasyon sonra. 0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi kitaplıkları arındırmak ve 20 µL TE arabellekte elute. DsDNA Nefelometri reaktif kullanarak kütüphaneleri üretici göre quantitate ' s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi). Saklamak-20 ° C’de örnekleri ya da kitaplık analizi ile devam. 9. Kütüphane analizi ve birbirinin Her kitaplık kalitesini belirlemek ve bir dijital Elektroforez sistemi kullanarak ortalama parça boyutu tahmin ediyoruz. Not: Ortalama parça boyutu nereye electropherogram eğri altındaki alan yarıya, tahmin etme tarafından değerlendirilir doruklarına gelen işaretleri göz ardı ederek. Uygun Kütüphane profilleri KOH veya KCl tedaviden sonra temsilcisi sonuçları şekil 2A verilmiştir. Hesaplamak belgili tanımlık kütüphaneci konsantrasyonu (nM): (c/10 3) /(p*650)] * 10 9 nerede c ng/µL kütüphanede konsantrasyon ve p kan basıncı, ortalama parça boyutu içinde tahmini 9.1. Havuzu eşit molar miktarda 24 Kitaplıklar farklı dizin astar için sıralama ile güçlendirilmiş. 25 µL son hacmi ve konsantrasyonu 10 TE arabellek eklemek nM. Not: havuza alınmış için kitaplıklarına sayısına bağlı olarak, her kitaplık DNA’dan miktarı ayarlanır. Astar dimer algılanırsa 9.1 yaklaşık 130 farklı bir zirve adım’bp, Kütüphane havuzu son hacmi 25 µL, çünkü arıtma adım 0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi tekrarlanır ve DNA 25 µL TE buf eluted aşan fer. Belirleme dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak yeni kütüphane havuzu konsantrasyon ' s özellikleri ve ortalama zirve boyutu yukarıda açıklandığı gibi. Sıralama ve veri analizi (Bölüm 10 ve 11) devam. 10. Sıralama 75-base eşleştirilmiş uç sıralama havuza alınan kütüphaneler 12 tarihinde gerçekleştirmek. 11. veri analizi Trim bağdaştırıcısı dizileri, kaldırmak için tüm okuma filtre için kalite ve uzunluğu okuyun. Not: Bu yapılabilir cutadapt 1.2.1 20 ile komutunu kullanarak ‘ cutadapt -f fastq–maç-okuma-joker – m 15 – q 10 – bir NNNNNNN sessiz < dosya >’, nerede NNNNNNN gerçek bağdaştırıcı dizisi ile değiştirilir ve < dosya > olduğunu fastq dosya adıyla değiştirilir. Özel komut dosyaları kullanarak önceki adımda arkadaşları, atılan bir okuma kaldırmak. Kalan dostum 1 hizalamak çiftleri Kütüphane hazırlanmasında kullanılan tüm oligonucleotides dizisini içeren bir dizine (papyon 0.12.8 21 ve komut satırı kullanarak Örneğin, seçenekleri – m1-v2). Tüm çiftleri ile başarılı hizalamaları atın. Kalan çift papyon ile komut satırını kullanarak canlı referans genomunun büyüklüğü için hizalama seçenekleri – v2 -X 10000–en iyi. Harita okur arasında mitokondrial molekülü başında ve sonunda o span dostum 1 tüm hizalanmamış çiftlerinin hizalayarak (papyon ile komut satırını kullanarak seçenekleri – v2). 5´-amaçları için tüm tek ve eşleştirilmiş son hizalamaları sayısını belirler. Bunlar bir baz akıntıya karşı tarafından konumunu nerede olduğunu hydrolyzed ribonucleotides konumuna kaydırmak. Papyon dosya verme verileri özel komut dosyaları kullanarak görselleştirme için ortak bir bedgraph dosya biçimine genom tarayıcılar biçimlendirin. Okuma her strand için okuma normalize milyon. Sayar ve pozisyon bedgraph dosyasını kullanarak başvuru Ltd.Şti kimliğini belirlemek için organizma genom dizisiorated ribonucleotides. Not: bölgeleri 16,200-300 ve 5,747-5,847 için insan mitokondriyal genom okur için bu bölgelerdeki birçok ücretsiz 5´ biter ribonucleotide birleşme için DNA polimeraz γ tarafından ilgisiz içerdiğinden her strand çıkarılmalıdır. Okuma okuma ribonucleotides tek iplikçik sonu, (Yani mitokondrial molekülü başına ribonucleotides sayısı) başına sayısını elde etmek için HincII site başına ortalama sayısı ile onbir HincII sitelerde hariç toplam okuma bölmek.