동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

이 그림 1에서 설명 하는 프로토콜과 gDNA, ribonucleotides, 치료는에 알칼리 수를 quantitate 수 금지 효소로 소화의 절연 ribonucleotides의 phosphodiester 채권 gDNA, 무료 5´ 오 끝의 인 산화, 어댑터, 두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭 시퀀싱 전에 ssDNA 결 찰에 통합. 1. 어댑터 및 인덱스 뇌관 얻을 ARC49 ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, 어댑터, ARC78-ARC107 인덱스 뇌관 (표 1 참조). 참고: Oligonucleotides HPLC 정화 해야 합니다. ARC76/77 이중으로 정렬 됩니다. 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 각 oligonucleotide의 준비 100 µ M 재고 솔루션 (재료의 표 참조)-20에서 저장 ° c. 차입 버퍼 (EB, 참조 테이블의 재료)에 희석 하 여 ARC67/77의 10 µ M 솔루션 및 ARC49 및 인덱스 뇌관의 2 µ M 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 게 2. 성장과 수확의 셀 성장 HeLa 세포 70 ml Dulbecco ' s 37에 250 mL 스피너 플라스 크에서 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보완 수정이 글 매체 (DMEM) ° c. 셀의 수를 계산 하 고 50 mL 튜브, 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에서에서 5 x 10 6 세포를 수집 하 고는 상쾌한 삭제. 1 x 20 mL PBS, 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기를 가진 세포를 세척 하 고는 상쾌한 삭제. 동결-20 ° C에서 펠 릿 또는 DNA 정화 계속. 3. DNA 정제 및 정량 gDNA 아래에 설명 된 페 놀-클로 프롬 적 출을 사용 하 여 정화. Resuspend 2 mL 세포의 용 해 버퍼의 셀 (테이블의 자료 참조)와 열 블록에 42 ° C에서 30 분 동안 품 어. 주의: 세포의 용 해 버퍼 유해 구성 요소를 포함합니다. SDS 솔루션은 자극, 가수분해 K은 sensitizing, 자극, 및 독성. 보호 옷과 장갑을 착용. 두 2 mL 튜브에 샘플을 분할 하 고 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜 (25:24:1)의 1 볼륨 (V) 추가. 주의: 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜은 독성, 변이 원 성, 부식성, 및 수생 환경에 유해. 증기 두건에서 사용 하 고, 보호 옷과 장갑을, 착용 하 고 특별 한 페 놀-클로 프롬 폐기물에서 폐기. 실 온에서 30-60 s에 대 한 반전 및 15000 x 5 분 원심 분리기 믹스 g. 참고: 결과 왜곡할 것 이다 무작위 스트랜드 나누기 소개 피하려고 하지 소용돌이 DNA 할. 새 2 mL 튜브 위, 수성 단계 전송 및 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜 (25:24:1)의 V 1. 반전 및 원심 분리기에서 15000 x g 4에 5 분 동안 혼합 ° c. 전송 20 µ L을 추가 하 고 새로운 2 mL 튜브에 위, 수성 단계 NaCl (5m)과 차가운 소 프로 파 놀의 V 1. 주의: 소 프로 파 놀, 자극, 가연성 및 독성입니다. 통풍이 캐비닛에 그것을 저장, 보호 옷과 장갑, 착용 하 고 화 염에서 멀리 유지. 반전 하 여 혼합 및 적어도 1 h-20에 대 한 품 어 ° c. G, 4 ° C와 폐기 상쾌한 x 15, 000에서 20 분 동안 원심 분리기. 세척 DNA 펠 릿 200 µ L 찬 70% 에탄올, 4 ° C에서 15000 x g에서 20 분 동안 원심 및 상쾌한 삭제. 주의: 70% 에탄올은 가연성 및 자극. 통풍이 캐비닛, 보호 옷을 입고, 장갑,-20 ° C, 그렇지 않으면 저장소에서 작업 솔루션을 유지 하 고 화 염에서 멀리 유지. DNA 펠 릿 20-25 분에 대 한 실 온에서 건조 100 µ L 테 펠 릿 분해 DNA 버퍼링 하 고 1 개의 관에 샘플 수영장. Quantitate DNA 농도 제조 업체에 따르면 dsDNA 정량 시 약을 사용 하 여 ' s 사양 (재료의 표 참조). 참고: dsDNA 정량 시 약을 사용 하는 spectrophotometric DNA 정량 잔여 페 놀에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에. -20 ° C에 게 DNA HincII 치료를 계속 하거나. 4. HincII 치료와 알칼리 가수분해 5 µ L 10 x 버퍼 3.1, 1 µ L (10 U)를 포함 하는 반응에서 다이제스트 1 µ g의 DNA 혼합 HincII, 및 nuclease 무료 H 2 O 50 µ L의 최종 볼륨을. 참고: 결 찰에 대 한 최적의 조건을 달성 하기 위해, 두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭, 그것은 필요할 수 있습니다 예상 된다 DNA ribonucleotides의 매우 낮은 수를 포함 하는 경우 입력된 DNA 양을 증가 시키는. 마찬가지로, 그것은 ribonucleotides의 수는 매우 높은 경우 입력된 DNA를 감소 해야 할 수도 있습니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 정화 HincII 치료 DNA 상자성 구슬. 참고: 관 뚜껑 열고 튜브를 열어서 펠 렛을 방해 하지 하려면 다음 단계에 계속. 각 상자성 구슬의 1.8 V 추가 샘플, 신중 하 게 pipetting, 혼합 및 10 분에 대 한 실 온에서 품 어 작은 구슬 5 분에 대 한 다음 제거 하 고 상쾌한을 버리고 자기 랙 사용. 약 30 s 다음 제거 및 삭제는 상쾌한 70% 에탄올 (실내 온도)의 150 µ L와 펠 릿을 세척. 세척 약 30 70% 에탄올 (실내 온도)의 200 µ L와 펠 릿 s 다음 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 참고: 잔여 에탄올 10 µ L 피 펫으로 제거할 수 있습니다. 방울 짧게 미리 내려 버리고 수. 건조 약 15-20 분에 대 한 실 온에서 샘플 참고: 정확한 시간 구슬의 볼륨 및 펠 릿의 모양에 따라 달라 집니다, 산 탄을 시각적으로 확인 한다 따라서. 자석 선반에서 튜브를 제거 하 고 45 µ L EB, 신중 하 게 pipetting으로 혼합에에서 펠 릿을 elute. 5 분 다음 작은 자석 선반에 구슬 하 고 순화 된 DNA의 45 µ L를 사용 하 여 단계 4.4에서에서 품 어. 코 (3 M) 또는 50 µ L의 총 볼륨을 만드는 DNA에 KCl (3 M)의 추가 5 µ L. 주의: 3 M 코 솔루션 부식성입니다. 보호 옷과 장갑을 착용. 품은 교 잡에서 55 ° C에서 2 h 오븐 얼음에 5 분 뒤 참고: 것이 좋습니다 튜브의 균일 한가 열을 유지 하 고 뚜껑에 결로 방지 난방 블록 보다는 오븐에 코 치료를 수행 하. 침전 DNA 10 µ L 나트륨 아세테이트를 추가 하 여 (3 M, pH = 5.2) 및 125 µ L 감기 100% 에탄올. 5 분 ice에 품 어 주의: 100% 에탄올은 가연성 및 자극. 통풍이 캐비닛에 저장, 보호 옷과 장갑을, 착용 하 고 화 염에서 유지. Centrifuging 21000 x g, 5 분 동안 4 ° C에 의해 gDNA를 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제. 세척 DNA 펠 릿 250 µ L 찬 70 %EtOH, 21000 x g, 5 분, 4 ° C에서 원심 및 삭제는 상쾌한. 참고: 제거 하려면 방울, 튜브 수 수 스핀 다운 짧게 다시 하 고 상쾌한 10 µ l 피 펫 제거 될 수 있다. 게 보이는 어떤 액체 증발 될 때까지 약 5-10 분 동안 열려 튜브에서 건조 하는 펠 릿. 실 온에서 30 분 동안 20 µ L EB에에서 게 DNA 펠 릿 디졸브. 5. 5´ 끝 인 산화 각 샘플 미리 죄수 반응 혼합 준비T4 polynucleotide 키 니 아 제 반응 버퍼, 1 µ L (10 U) 3´-인산 가수분해 효소-마이너스 T4 polynucleotide 키 니 아 제, 및 2.5 µ L ATP (10mm) x 2.5 µ L 10의 isting. 전송 19 µ L 각 DNA의 새로운 200 µ L 관으로 샘플 및 열 cycler에서 85 ° C에서 3 분 변성. 멋진 DNA 얼음에 샘플링 하 고 반응 혼합의 6 µ L 각 샘플 추가. 30 분 및 중지 20 분 65 ° C에서 샘플을 배양 하 여 반응 하는 37 ° C에서 품 반응 혼합 정화 DNA로 4.3에 상자성 구슬의 1.8 V를 사용 하 여 설명 하지만 14 µ L EB에에서 elute. 6. ssDNA 결 찰 0.5 µ L ATP (2mm), T4 RNA 리가 반응 버퍼, 5 µ L CoCl 3 (NH 3) 6 (10 m m), x 5 µ L 10의 사전에 구성 된 각 샘플에 대 한 반응 혼합 준비 0.5 µ L ARC140 (100 µ M), 25 µ L 50% 말뚝 8000. Pipetting으로 잘 믹스. 주의: CoCl 3 (NH 3) 6 이며 발암, sensitizing, 수생 환경 유해. 보호 옷과 장갑을 착용. 전송 13 µ L에서 순화 된 DNA의 새로운 200 µ L 튜브 5.5 단계와 열 cycler에서 85 ° C에서 3 분 변성. 차가운 얼음에 DNA 각 샘플, pipetting, 혼합 반응 혼합의 36 µ L을 추가 하 고 간단히 스핀 다운. 추가 1 µ L (10 U) T4 RNA 리가의 각 반응에 pipetting, 혼합 하 고 짧게 스핀 다운. 어두운 하룻밤에 실 온에서 샘플을 품 어. 7. 두 번째 가닥 합성 4.3에 설명 된 대로 Purify DNA 출혈 하지만 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여, 작은 구슬 10 분 및 20 µ L EB에에서 elute. 참고: 결 찰 반응 혼합의 높은 점도 인해 pelleting의 첫 번째 단계는 연장. 전송 20 µ L 새로운 200 µ L PCR 튜브에 DNA 샘플의. 제조 업체에 따라 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여 정화 단계 반복 ' s 사양 및 14 µ L EB에에서 elute. 10 x T7 DNA 중 합 효소 반응 버퍼, 2 µ L의 2 µ L의 사전에 구성 된 각 샘플에 대 한 반응 혼합 준비 ARC76/77 (2 µ M), 2 µ L dNTPs (2mm), 및 0.8 µ L BSA (1 mg/mL). 새 200 µ L 튜브에 DNA를 정화 하는 전송 12.8 µ L, 열 cycler에서 85 ° C에서 3 분 변성. 얼음에 DNA를 냉각 하 고 각 샘플, pipetting으로 혼합, 짧게, 스핀 다운 및 실 온에서 5 분 동안 품 어 반응 혼합의 6.8 µ L 추가. 각 반응에 0.4 µ L (4 U) T7 DNA 중 합 효소를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 정화 DNA로 4.3에 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여 설명과 11 µ L EB에에서 elute. 8. PCR 증폭 및 라이브러리 정량 준비 새로운 200에서 각 샘플에 대 한 반응 혼합물 µ L 튜브 7.5 µ L의 미리 구성 된 ARC49 (2 µ M), 7.5 µ L 인덱스 뇌관 (2 µ M, 각 샘플에 대 한 독특한), 그리고 뜨거운 시작 x 25 µ L 2 준비 믹스. 각 반응에 DNA 샘플의 추가 10 µ L. 다음 조건을 사용 하 여 라이브러리를 증폭: 95 ° C 45에서 변성 15 98 ° C의 18 주기 다음 s s, 30 위한 65 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s, 72 ° c에서 4 °에서 2 분 대기 샘플에 대 한 최종 신장으로 끝나는 증폭 후 C. 4.3, 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여에 설명 된 대로 라이브러리를 정화 하 고 20 µ L TE 버퍼에 elute. 제조 업체에 따르면 dsDNA 정량 시 약을 사용 하 여 라이브러리를 quantitate ' s 사양 (재료의 표 참조). 샘플-20 ° C에서 저장 하거나 라이브러리 분석 계속. 9. 라이브러리 분석 및 풀링은 각 라이브러리의 품질을 결정 하 고 디지털 전기 시스템을 사용 하 여 평균 조각 크기를 추정. 참고: 평균 조각 크기는 electropherogram의 곡선 아래의 영역은 절반으로 추정 하 여 평가 무시 하는 표식에서 봉우리. 코 또는 KCl 치료 후 적당 한 라이브러리 프로필의 대표적인 결과 그림 2A에 부여 됩니다. 계산으로 라이브러리의 농도 (nM): (c/10 3) /(p*650)] * 10 9 어디 c ng / µ L에서 라이브러리의 농도 이며 p 혈압, 평균 조각 크기에 예상된 9.1로. 풀 같은 어 금 니 양의 최대 24 라이브러리 시퀀싱에 대 한 다른 인덱스 뇌관으로 증폭. 25 µ L의 최종 볼륨을 10의 농도 테 버퍼를 추가 nM. 참고: 라이브러리 풀링할 수에 따라 각 도서관에서 DNA의 금액은 조정 됩니다. 뇌관 이합체 경우 단계에서 9.1 약 130의 뚜렷한 피크로 정화 단계 4.3, 상자성 구슬, 0.8 V를 사용 하 여에 설명 된 대로 반복 되 고 DNA는 eluted 25 µ L 테 buf에 때문에 bp, 라이브러리 풀의 최종 볼륨 25 µ L를 초과할 수 그다지입니다. 결정 제조 업체에 따르면 dsDNA 정량 시 약을 사용 하 여 새 라이브러리 풀 농도 ' s 사양 및 평균 피크 크기 위에서 설명한. 시퀀싱 및 데이터 분석 (섹션 10 및 11) 진행. 10. 시퀀싱 풀링된 라이브러리 12 75-자료 쌍-엔드 시퀀싱을 수행. 11. 데이터 분석 트림 어댑터 시퀀스를 제거 하려면 모든 읽기 품질에 대 한 필터링 및 길이 읽기. 참고:이 수행할 수 명령으로 cutadapt 1.2.1 20을 사용 하 여 ‘ cutadapt-f fastq-와일드 카드 일치-읽기–조용한-m 15-q 10-한 NNNNNNN < 파일 >’, NNNNNNN 실제 어댑터 시퀀스로 대체 됩니다 및 < 파일 >는 fastq 파일 이름으로 바뀝니다. 사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 이전 단계에서 삭제 된 읽기의 동료를 제거. 남은 친구 1 정렬 라이브러리 준비에 사용 되는 모든 oligonucleotides의 시퀀스를 포함 하는 인덱스에 쌍 (예를 들어, Bowtie 0.12.8 21와 명령줄을 사용 하 여 옵션-m1-v2). 성공적인 정렬 모든 쌍 삭제. Bowtie 명령줄과 함께 사용 하 여 유기 체 참조 게놈을 나머지 쌍 정렬 옵션-v 2-X 10000-최고. 지도 모든 정렬 되지 않은 쌍의 친구 1을 정렬 하 여 미토 콘 드 리아 분자 시작과 끝 사이의 간격을 읽고 (Bowtie 명령줄과 함께 사용 하 여 옵션-v2). 모든 단일 및 결합 끝 정렬에 대 한 5´-끝의 수를 결정합니다. 분해 된 ribonucleotides가 있던 위치에 이러한 기본 상류의 위치를 이동. Bowtie 파일에서 데이터를 내보낼 게놈 브라우저 공통 시각화에 대 한 사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 bedgraph 파일 형식으로 서식을. 각 가닥 당 읽기에 대 한 읽기를 정상화 백만. Incorp의 정체성을 결정 하는 유기 체 게놈 시퀀스를 참조 bedgraph 파일에서 위치 및 개수를 사용 하 여ribonucleotides orated. 참고: 인간 미토 콘 드리 아 게놈 16,200-300 및 5,747-5,847에 대 한 영역에서 읽기에 대 한 각 제외 되어야 이후이 지역 많은 무료 5´-끝 ribonucleotide 법인 DNA 중 합 효소 γ에 의해 무관 포함. 분할 단일 가닥 휴식, (즉, 미토 콘 드 리아 분자 당 ribonucleotides의 수) 당 ribonucleotides의 번호를 HincII 사이트 당 읽기 평균 수와 11 HincII 사이트에서 읽기를 제외한 총 읽습니다.