Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови
Summary
Мы описываем метод для производства человеческих антител специфических для антигена интереса, начиная от редких B-клетки, циркулирующие в крови человека. Поколение этих естественных антител является эффективным и быстрым, и полученные антитела могут различать высоки родствены антигены.
Abstract
Моноклональные антитела (mAbs) являются мощными инструментами, полезны для обеих фундаментальных исследований и в биомедицине. Их высокая специфичность незаменима, когда антитела необходимо различать высоко соответствующих структур (например, нормальный белок и мутировавших версии их). Текущий способ генерации такие дискриминационные mAbs включает в себя обширный показ нескольких Ab продуцирующих клеток, который является дорогостоящим и трудоемким. Мы предлагаем здесь быстрый и рентабельный метод для генерации дискриминационный, полностью человека mAbs, начиная от циркулирующих лимфоцитов крови человека. Оригинальность этой стратегии объясняется выбор специфического антигена привязки B клеток в сочетании с борьбе с выбором всех остальных ячеек, с помощью легко доступных периферической крови одноядерных клеток (КСДОР). После того, как конкретные клетки B изолированы, cDNA (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) последовательности кодирования для соответствующего МАБ получаются с помощью технологии отдельной ячейки обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и впоследствии выразил в человека клетки. В течение всего за 1 месяц можно производить миллиграммов весьма дискриминационный человека mAbs, направленных против практически любого желаемого антигена, естественно обнаружены клетки B репертуар.
Introduction
Метод, описанный здесь позволяет быстрый и универсальный производства полностью человеческих моноклональных антител (mAbs) против желаемого антигена (Ag). mAbs являются важнейшими инструментами во многих фундаментальных исследований приложений в пробирке и в естественных условиях: поток цитометрии, гистология, Западный blotting и блокирования эксперименты, например. Кроме того mAbs используются более в медицине для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и для управления трансплантации отклонение1. Например анти CTLA-4 и анти PD-1 (или анти PD-L1) mAbs недавно использовались как ингибиторы иммунной контрольно-пропускной пункт в рака лечение2.
Первый mAbs были произведены иммуноглобулина (Ig)-секретирующих hybridomas полученные из клеток splenic иммунизированной мыши или крысы. Однако сильный иммунный ответ против мышиных или крыса mAbs препятствует их терапевтического использования в людей, из-за их быстрое разминирование и вероятных индукции реакций гиперчувствительности3. Для решения этой проблемы, животного белка последовательности mAbs были частично заменены на человека для создания так называемых химерных мыши человека или гуманизированные антитела. Однако эта стратегия лишь частично уменьшается иммуногенность, существенно увеличивая стоимость и сроки производства. Лучшее решение заключается в создании человека mAbs непосредственно из клеток человека B и несколько стратегий для этого. Один из них является использование фага или дрожжи дисплея. Это включает отображение переменной доменов из библиотеки комбинаторной случайных человеческий Ig тяжелых и легких цепей на бактериофаги или дрожжей и проведение отбора шаг, используя специфический антиген интереса. Основным недостатком данной стратегии является случайным образом связаны, приводит к очень большое увеличение в разнообразии сгенерированный антител тяжелых и легких цепей. Антитела, которые получены вряд ли соответствуют тем, которые возникнут в результате естественной иммунный ответ против особенно Ag. Кроме того сворачивание белков человека и столб-поступательные изменения не воспроизводятся систематически в прокариотах или даже дрожжей. Второй метод производства человека МАБ-увековечении естественных человеческих клеток B инфекции вирусом Эпштейна – Барр или выражением анти apoptotic факторов BCL-6 и BCL-XL4. Однако этот метод применим только к ячейкам памяти B и является неэффективным, требующие проверки многочисленных МАБ производители увековечен клеток B определить несколько (если таковые имеются) МАБ клоны с желаемой антигенной специфичности. Таким образом, этот метод является дорогостоящим и трудоемким.
Недавно был описан новый протокол для производства человеческого mAbs от изолированных одной клетки B5. Он полагается на оптимизированной одноклеточных обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для усиления из обоих тяжелых – и свет цепи кодирования сегменты из одной клетки B сортировки. Это сопровождается клонирования и выражение этих сегментов в системе эукариотических выражения, таким образом позволяя реконструкция полностью человека МАБ. Этот протокол был использован успешно начиная с B клеток от вакцинированных доноров. Клетки были собраны через несколько недель после вакцинации для получения высоких частот клеток B, направленных против желаемого Ag и таким образом ограничить время, необходимое для скрининга6. Были также подготовлены другие полностью человека mAbs от инфицированных ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)+ больных7 и меланома пациентов8. Несмотря на эти успехи до сих пор не существует процедуры доступны, что позволяет изоляции Ag специфические клетки независимо от их памяти фенотип или частоты.
Процедура описана здесь приводит к изоляции эффективным ex vivo человека циркулирующих клеток B, основанный на специфике их BCR, следуют производство полностью человека антиген специфические mAbs высокой урожайности и с низкой скрининга время. Метод не ограничивается ячеек памяти B или антител секретирующие клетки B индуцированных после иммунного ответа, но может также применяться к Справочнику B клеток человека наивными. Что он работает даже начиная с B Ag специфические клетки присутствуют на очень низких частотах является хорошим показателем эффективности его работы. Принцип метода является следующим: мононуклеарных клеток периферической крови (КСДОР) окрашенных с двумя тетрамера, представляя антигена интереса, каждый обозначен с различными флюрохром (например, фикоэритрин (PE) и аллофикоцианин (APC)), и третий Тетрамер, представляя тесно связанных антигена проспряганное с третьего флюрохром (например, Brillant фиолетовый 421 (BV421)). Для обогащения для антиген связывая клетки, клетки затем инкубируют с бисером, с анти PE покрытием и анти APC Abs и отсортированных в ячейке разделения столбцов. Фракция клеток БТР PE+ + выбран, окрашенных с различными mAbs конкретные для различных типов клеток КСДОР для идентификации клеток B и подвергли течь цитометрии сортировки клеток. B-клетки, которые являются PE+ и APC+, но блестящий фиолетовый–, являются изолированными. Этот шаг выбирает часовой клетки, которые не являются клетки B или не связывайте к tetramerized антигену, но связывать PE или APC (эти клетки будет PE+ APC– или PE– APC+) или часть-антигена тетрамера используется (эти клетки будут BV421+). B не весьма специфический для эпитопов интерес также часовой выбраны ячейки на этом шаге (эти клетки также будут BV421+). Таким образом этот метод может очистить весьма специфические клетки B, выражая B-клеточные рецепторы (БКРС) способны различать два очень тесно связанных антигены. Отдельные конкретные ячейки B собираются в трубы и их усиленный ПЦР Ig cDNAs (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) клонирован и выразил линией клеток человека как секретируемые mAbs IgG.
Как доказательство концепции, это исследование описывает эффективным поколения человека mAbs, которые признают пептид представлены классом комплекс гистосовместимости I (MHC-I) молекулы и может различать этот пептид и других пептидов, загружены на том же MHC-I аллеля. Хотя уровень сложности этого Ag имеет важное значение, этот метод позволяет (i) высокодоходных восстановления Ag конкретных mAbs; (ii) производство mAbs состоянии различать между двумя структурно закрыть Ags. Этот подход может быть расширен для прививки или зараженных пациентов без каких-либо изменений в протокол, а также уже успешно реализованы в системе гуманизированные крыса9. Таким образом это исследование описывает универсальный и эффективный подход к генерации mAbs полностью человеком, который может быть использован в фундаментальные исследования и иммунотерапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предлагаемый протокол является мощный метод для генерации человека mAbs непосредственно от Ag конкретных B клетки, циркулирующие в крови. Она сочетает в себе три важных аспекта: (i) использование связанных Тетрамер магнитного обогащения, который позволяет ex vivo изоляции даже редкие Ag п…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим цитометрии объекта «CytoCell» (SFR Santé, Biogenouest, Нант) за экспертной технической помощи. Мы благодарим также всех сотрудников производство рекомбинантных белков (P2R) и влияние платформ (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Нант) за их техническую поддержку. Мы благодарим Emmanuel Scotet и Ричард Breathnach за конструктивные комментарии по рукописи. Эта работа была финансово поддержана IHU-Сести проект, финансируемый программой «Investissements будущее» французское правительство, управляемых по французского национального исследования агентства (НРА) (АНР-10-IBHU-005). IHU-Сести проект поддерживается также Métropole Нант и округов Луары. Эта работа была реализована в рамках программы LabEX IGO, поддержке национального исследовательского агентства через инвестиций будущего программы НРУ-11-LABX-0016-01.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
