Summary

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Мы описываем метод для производства человеческих антител специфических для антигена интереса, начиная от редких B-клетки, циркулирующие в крови человека. Поколение этих естественных антител является эффективным и быстрым, и полученные антитела могут различать высоки родствены антигены.

Abstract

Моноклональные антитела (mAbs) являются мощными инструментами, полезны для обеих фундаментальных исследований и в биомедицине. Их высокая специфичность незаменима, когда антитела необходимо различать высоко соответствующих структур (например, нормальный белок и мутировавших версии их). Текущий способ генерации такие дискриминационные mAbs включает в себя обширный показ нескольких Ab продуцирующих клеток, который является дорогостоящим и трудоемким. Мы предлагаем здесь быстрый и рентабельный метод для генерации дискриминационный, полностью человека mAbs, начиная от циркулирующих лимфоцитов крови человека. Оригинальность этой стратегии объясняется выбор специфического антигена привязки B клеток в сочетании с борьбе с выбором всех остальных ячеек, с помощью легко доступных периферической крови одноядерных клеток (КСДОР). После того, как конкретные клетки B изолированы, cDNA (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) последовательности кодирования для соответствующего МАБ получаются с помощью технологии отдельной ячейки обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и впоследствии выразил в человека клетки. В течение всего за 1 месяц можно производить миллиграммов весьма дискриминационный человека mAbs, направленных против практически любого желаемого антигена, естественно обнаружены клетки B репертуар.

Introduction

Метод, описанный здесь позволяет быстрый и универсальный производства полностью человеческих моноклональных антител (mAbs) против желаемого антигена (Ag). mAbs являются важнейшими инструментами во многих фундаментальных исследований приложений в пробирке и в естественных условиях: поток цитометрии, гистология, Западный blotting и блокирования эксперименты, например. Кроме того mAbs используются более в медицине для лечения аутоиммунных заболеваний, рака и для управления трансплантации отклонение1. Например анти CTLA-4 и анти PD-1 (или анти PD-L1) mAbs недавно использовались как ингибиторы иммунной контрольно-пропускной пункт в рака лечение2.

Первый mAbs были произведены иммуноглобулина (Ig)-секретирующих hybridomas полученные из клеток splenic иммунизированной мыши или крысы. Однако сильный иммунный ответ против мышиных или крыса mAbs препятствует их терапевтического использования в людей, из-за их быстрое разминирование и вероятных индукции реакций гиперчувствительности3. Для решения этой проблемы, животного белка последовательности mAbs были частично заменены на человека для создания так называемых химерных мыши человека или гуманизированные антитела. Однако эта стратегия лишь частично уменьшается иммуногенность, существенно увеличивая стоимость и сроки производства. Лучшее решение заключается в создании человека mAbs непосредственно из клеток человека B и несколько стратегий для этого. Один из них является использование фага или дрожжи дисплея. Это включает отображение переменной доменов из библиотеки комбинаторной случайных человеческий Ig тяжелых и легких цепей на бактериофаги или дрожжей и проведение отбора шаг, используя специфический антиген интереса. Основным недостатком данной стратегии является случайным образом связаны, приводит к очень большое увеличение в разнообразии сгенерированный антител тяжелых и легких цепей. Антитела, которые получены вряд ли соответствуют тем, которые возникнут в результате естественной иммунный ответ против особенно Ag. Кроме того сворачивание белков человека и столб-поступательные изменения не воспроизводятся систематически в прокариотах или даже дрожжей. Второй метод производства человека МАБ-увековечении естественных человеческих клеток B инфекции вирусом Эпштейна – Барр или выражением анти apoptotic факторов BCL-6 и BCL-XL4. Однако этот метод применим только к ячейкам памяти B и является неэффективным, требующие проверки многочисленных МАБ производители увековечен клеток B определить несколько (если таковые имеются) МАБ клоны с желаемой антигенной специфичности. Таким образом, этот метод является дорогостоящим и трудоемким.

Недавно был описан новый протокол для производства человеческого mAbs от изолированных одной клетки B5. Он полагается на оптимизированной одноклеточных обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для усиления из обоих тяжелых – и свет цепи кодирования сегменты из одной клетки B сортировки. Это сопровождается клонирования и выражение этих сегментов в системе эукариотических выражения, таким образом позволяя реконструкция полностью человека МАБ. Этот протокол был использован успешно начиная с B клеток от вакцинированных доноров. Клетки были собраны через несколько недель после вакцинации для получения высоких частот клеток B, направленных против желаемого Ag и таким образом ограничить время, необходимое для скрининга6. Были также подготовлены другие полностью человека mAbs от инфицированных ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)+ больных7 и меланома пациентов8. Несмотря на эти успехи до сих пор не существует процедуры доступны, что позволяет изоляции Ag специфические клетки независимо от их памяти фенотип или частоты.

Процедура описана здесь приводит к изоляции эффективным ex vivo человека циркулирующих клеток B, основанный на специфике их BCR, следуют производство полностью человека антиген специфические mAbs высокой урожайности и с низкой скрининга время. Метод не ограничивается ячеек памяти B или антител секретирующие клетки B индуцированных после иммунного ответа, но может также применяться к Справочнику B клеток человека наивными. Что он работает даже начиная с B Ag специфические клетки присутствуют на очень низких частотах является хорошим показателем эффективности его работы. Принцип метода является следующим: мононуклеарных клеток периферической крови (КСДОР) окрашенных с двумя тетрамера, представляя антигена интереса, каждый обозначен с различными флюрохром (например, фикоэритрин (PE) и аллофикоцианин (APC)), и третий Тетрамер, представляя тесно связанных антигена проспряганное с третьего флюрохром (например, Brillant фиолетовый 421 (BV421)). Для обогащения для антиген связывая клетки, клетки затем инкубируют с бисером, с анти PE покрытием и анти APC Abs и отсортированных в ячейке разделения столбцов. Фракция клеток БТР PE+ + выбран, окрашенных с различными mAbs конкретные для различных типов клеток КСДОР для идентификации клеток B и подвергли течь цитометрии сортировки клеток. B-клетки, которые являются PE+ и APC+, но блестящий фиолетовый, являются изолированными. Этот шаг выбирает часовой клетки, которые не являются клетки B или не связывайте к tetramerized антигену, но связывать PE или APC (эти клетки будет PE+ APCили PE APC+) или часть-антигена тетрамера используется (эти клетки будут BV421+). B не весьма специфический для эпитопов интерес также часовой выбраны ячейки на этом шаге (эти клетки также будут BV421+). Таким образом этот метод может очистить весьма специфические клетки B, выражая B-клеточные рецепторы (БКРС) способны различать два очень тесно связанных антигены. Отдельные конкретные ячейки B собираются в трубы и их усиленный ПЦР Ig cDNAs (дополнительных дезоксирибонуклеиновой кислоты) клонирован и выразил линией клеток человека как секретируемые mAbs IgG.

Как доказательство концепции, это исследование описывает эффективным поколения человека mAbs, которые признают пептид представлены классом комплекс гистосовместимости I (MHC-I) молекулы и может различать этот пептид и других пептидов, загружены на том же MHC-I аллеля. Хотя уровень сложности этого Ag имеет важное значение, этот метод позволяет (i) высокодоходных восстановления Ag конкретных mAbs; (ii) производство mAbs состоянии различать между двумя структурно закрыть Ags. Этот подход может быть расширен для прививки или зараженных пациентов без каких-либо изменений в протокол, а также уже успешно реализованы в системе гуманизированные крыса9. Таким образом это исследование описывает универсальный и эффективный подход к генерации mAbs полностью человеком, который может быть использован в фундаментальные исследования и иммунотерапии.

Protocol

Все образцы периферической крови человека были получены от анонимных взрослых доноров после обоснованного согласия, в соответствии с местными Этический Комитет (Etablissement Français du пел, EFS, Нант, процедура PLER NTS-2016-08). 1. изоляция мононуклеаров периферической крови человека <p c…

Representative Results

Начиная от КСДОР от здоровых доноров, этот проект представляет поколения человека mAbs, которые признают пептидные Pp65495 (Pp65, от человека цитомегаловирус) представил комплекс гистосовместимости класса I (MHC-I) молекулы HLA – A * 0201 () HLA-A2). Эти mAbs можно различать этот компл?…

Discussion

Предлагаемый протокол является мощный метод для генерации человека mAbs непосредственно от Ag конкретных B клетки, циркулирующие в крови. Она сочетает в себе три важных аспекта: (i) использование связанных Тетрамер магнитного обогащения, который позволяет ex vivo изоляции даже редкие Ag п…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим цитометрии объекта «CytoCell» (SFR Santé, Biogenouest, Нант) за экспертной технической помощи. Мы благодарим также всех сотрудников производство рекомбинантных белков (P2R) и влияние платформ (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Нант) за их техническую поддержку. Мы благодарим Emmanuel Scotet и Ричард Breathnach за конструктивные комментарии по рукописи. Эта работа была финансово поддержана IHU-Сести проект, финансируемый программой «Investissements будущее» французское правительство, управляемых по французского национального исследования агентства (НРА) (АНР-10-IBHU-005). IHU-Сести проект поддерживается также Métropole Нант и округов Луары. Эта работа была реализована в рамках программы LabEX IGO, поддержке национального исследовательского агентства через инвестиций будущего программы НРУ-11-LABX-0016-01.

Materials

HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC
Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Play Video

Cite This Article
Devilder, M., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

View Video