Summary

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

Abstract

נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) הינם כלים רבי-עוצמה שימושי עבור שניהם מחקר בסיסי ב וההתערבות. ירידה לפרטים גבוהה שלהם היא הכרחית כאשר הנוגדן צריך להבחין בין מבנים הקשורים במידה רבה (למשל, חלבון רגיל, גרסה מוטציה הימנו). הדרך הנוכחית של יצירת mAbs שמסווגת כזה כרוך ההקרנה נרחב של תאים מייצרי Ab B מרובים, וזה גם יקר וגם זמן רב. אנו מציעים כאן שיטה מהירה וחסכונית לדור של שמסווגת, mAbs אנושית לחלוטין, החל מדם אנושי במחזור B לימפוציטים. מקוריות אסטרטגיה זו נובעת בחירת התאים איגוד B אנטיגן ספציפי בשילוב עם מבחר הנגד של כל התאים האחרים, שימוש זמינים היקפיים דם תאי תאים (PBMC). ברגע מסוים B תאים מבודדים, רצפים cDNA (חומצה deoxyribonucleic משלימים) קידוד mAb המתאימים מתקבלים תא בודד הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) בטכנולוגיית והביע לאחר מכן-אנוש תאים. בתוך מעט ככל 1 חודש, זה אפשרי לייצר מיליגרם של mAbs אנושי מאוד שמסווגת נגד כמעט כל אנטיגן הרצוי באופן טבעי שזיהה את הרפרטואר תא B.

Introduction

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ייצור מהיר ופסיביות של נוגדנים חד-שבטיים אנושית לחלוטין (mAbs) נגד אנטיגן הרצוי (Ag). mAbs הם כלים חיוניים רבים מחקר בסיסי יישומים בתוך חוץ גופית ו ויוו: flow cytometry, היסטולוגיה, ניסויים סופג המערבי, ואת החסימה לדוגמה. יתר על כן, mAbs נמצאים בשימוש יותר תרופות לטיפול במחלות אוטואימוניות, סרטן, וכדי לשלוט דחייה השתלת1. לדוגמה, mAbs אנטי-CTLA-4 ו- anti-PD-1 (או אנטי-PD-L1) לאחרונה שימשו מעכבי המערכת החיסונית מחסום טיפולי סרטן2.

MAbs הראשונה יוצרו על ידי אימונוגלובולין (Ig)-מפריש hybridomas המתקבל תאי הטחול של חיסון עכברים או חולדות. עם זאת, התגובה החיסונית חזקה נגד mAbs מאתר או עכברוש הסלים שלהם לשימוש טיפולית בבני אדם, בשל הסיווג שלהם מהירה של אינדוקציה סביר של רגישות יתר תגובות3. כדי להתמודד עם בעיה זו, פרוטאין מהחי רצפים של mAbs הוחלפו חלקית על-ידי אלה האדם לייצר נוגדנים העכבר-אנושי או humanized chimeric כביכול. עם זאת, אסטרטגיה זו פוחתת באופן חלקי בלבד immunogenicity, תוך הגדלת באופן משמעותי הן את העלות והן ציר-הזמן של ייצור. פתרון טוב יותר היא לייצר mAbs האנושי ישירות מתאי B האנושית, מספר אסטרטגיות זה הינם זמינים. אחד מהם הוא השימוש של תצוגת phage או שמרים. זה כולל הצגת תחומים משתנים מספרייה קומבינטורית של Ig אדם אקראי כבד, אור שרשראות phages או שמרים, ולא בביצוע שלב הבחירה באמצעות אנטיגן ספציפי של עניין. חיסרון גדול של אסטרטגיה זו היא שרשראות קלות וכבדות מקושרים באקראיות, שמוביל עלייה גדולה מאוד הרב-גוניות של נוגדנים שנוצרו. נוגדנים שהושג סביר להניח תואמים לאלה הנובעים מן תגובה חיסונית טבעית נגד Ag מסוים. יתר על כן, קיפול חלבונים האנושית והשינויים post-translational לא באופן שיטתי משוחזרות אאוקריוטים או אפילו בכל שמרים. שיטת הייצור mAb האדם השני הוא immortalization של תאים B אנושי טבעי, על ידי וירוס אפשטיין בר זיהום או ביטוי של גורמים אנטי-מוות BCL-6 ו- BCL-XL4. אולם, שיטה זו ישימה רק לתאי זיכרון B, הוא יעיל, הדורשים הקרנת רבים mAb immortalized B והתאים המייצרים לזהות שיבוטים mAb כמה (אם בכלל) עם יחודיות antigenic הרצוי. השיטה זו וכך גם יקר וגם זמן רב.

פרוטוקול חדש לאחרונה תואר לייצור mAbs אנושית מבודדת אחת B תאים5. זה מסתמך על אופטימיזציה בתא יחיד הפוך תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (RT-PCR) עבור הגברה של שני כבדים – ו אור-שרשרת קידוד מקטעי מתא B ממוינת יחידה. זה מלווה את שיבוט וביטוי של מקטעים אלה במערכת הביטוי האיקריוטים, ובכך לאפשר שחזור של mAb אנושית לחלוטין. פרוטוקול זה שימש בהצלחה מתחיל מתאי B מתורמים שחוסנו. תאים נבצרו מספר שבועות לאחר החיסון כדי להשיג תדרים גבוהים יותר של תאי B נגד היועץ המשפטי לממשלה הרצוי, ואת ובכך להגביל את משך הזמן הדרוש לסינון6. אחרים mAbs אנושית לחלוטין גם הופקו נשאי איידס+ (וירוס הכשל החיסוני האנושי) חולים7 ו מלנומה מטופלים8. למרות ההתפתחויות הללו, יש עדיין אין הליך זמין המאפשר את הבידוד של תאים ספציפיים Ag B עצמאית של פנוטיפ זיכרון או התדירות שלהם.

ההליך שמתואר כאן מוביל בידוד יעיל ex-vivo של תאי B במחזור אדם המבוסס על ירידה לפרטים BCR שלהם, ואחריו את הייצור של mAbs אנטיגן ספציפי אנושית לחלוטין תשואה גבוהה ועם זמן הקרנה נמוכה. השיטה אינה מוגבלת זיכרון B תאים או מפריש נוגדן תאי B המושרה לאחר תגובה חיסונית, אך ניתן להחיל גם על הרפרטואר תא B נאיבי האדם. זה עובד אפילו מתחיל מתאי B הספציפיים Ag, נוכח תדרים נמוכים מאוד היא אינדיקציה טובה של היעילות שלה. העקרון של השיטה הוא כדלקמן: היקפי דם תאי תאים (PBMC) מוכתמים tetramers שני מציג אנטיגן של עניין, כל אחת המסומנת fluorochrome שונים (למשל, Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APC)), tetramer השלישי מציג אנטיגן הקשורים קשר הדוק מצומדת עם fluorochrome השלישי (למשל, 421 ויולט Brillant (BV421)). להעשיר עבור תאים אנטיגן מחייב, תאים מודגרת ואז עם חרוזים מצופים אנטי-PE ו- Abs אנטי-APC, וממוינות תא ההפרדה עמודות. השבר תא APC PE+ + נבחר, ויטראז’ים עם מגוון רחב של mAbs ספציפיות עבור סוגים שונים של תאים PBMC לאפשר זיהוי של תאי B, ומתן וכפופים לזרום cytometry מיון תא. בתאי B שהן PE+ , APC+, אבל, ויולט מבריק מבודדים. שלב זה נגד בוחר תאים אשר אינם תאים B או אפשרות לאגד אנטיגן tetramerized, אך לאגד PE או APC (תאים אלו יהיו PE+ APCאו PE APC+) או לחלק הלא-אנטיגן של tetramers בשימוש (אלה התאים יהיה BV421+). בתאי B לא ספציפי מאוד עבור epitope עניין גם נבחרו נגד בשלב זה (תאים אלה יהיה גם BV421+). לכן, בשיטה זו ניתן לטהר ספציפי מאוד B תאים המבטאים קולטנים B-cell (BCRs) יכול להפלות בין שני אנטיגנים מאוד קרובים. תאים B ספציפיים בודדים נאספים צינורות, שלהם cDNAs Ig מוגבר-PCR (חומצות deoxyribonucleic משלימים) שיכפל והביע על-ידי קו תאים אנושיים כמו המופרש mAbs IgG.

מהווה הוכחה של המושג, מחקר זה מתאר הדור יעיל של mAbs האנושי, אשר מזהה פפטיד שהוצגו על-ידי מחלקה מורכבים histocompatibility הגדולות (MHC-אני) מולקולה, יכול להפלות בין פפטיד זה אחרים פפטידים טעון על אותו MHC-אני אלל. רמת המורכבות של Ag זה אמנם חשוב, שיטה זו מאפשרת (i) תשואה גבוהה שחזור של mAbs Ag ספציפיים; (ii) ייצור mAbs מסוגל להפלות בין שתי Ags קרובים מבחינה מבנית. גישה זו ניתן להרחיב את חוסנו או נגועים המטופלים ללא כל שינוי פרוטוקול, גם כבר בהצלחה הוכרז ב מערכת humanized החולדה9. לפיכך, מחקר זה מתאר בגישה רב תכליתי ויעיל להפקת mAbs אנושית לחלוטין שניתן להשתמש בהם מחקר בסיסי, חיסוני.

Protocol

כל דגימות דם היקפיים אדם התקבלו מתורמים אנונימיים למבוגרים לאחר הסכמה מדעת, על פי ועדת האתיקה המקומית (Etablissement פרנקאיס du שרו, EFS, נאנט, הליך PLER NTS-2016-08). 1. בידוד תאי תאי דם היקפיים אנושי הערה: החל חומר ניתן הכולל דם היקפיים אנושי או דגימות cytapheresis. לא צריך להיות מבוג?…

Representative Results

החל מ- PBMC מתורמים מאוד בריאים, זה פרויקט המתנות הדור של האדם mAbs, אשר מזהה את פפטיד Pp65495 (Pp65, מן האדם cytomegalovirus) שהוצגו על-ידי המחלקה מורכבת histocompatibility הגדולות אני (MHC-אני) מולקולה (הלע – A * 0201 HLA-A2). MAbs אלה יכול להפלות בין מתחם, מתחמי המייצג אחרים פפטידים מועמסים על MHC אותו זה-א?…

Discussion

הפרוטוקול המוצע היא שיטה חזקה לדור של mAbs האנושי ישירות מתאי B הספציפיים Ag במחזור הדם. היא משלבת שלושה היבטים חשובים: (i) שימוש tetramer-הקשורים מגנטי העשרה, המאפשרת בידוד שמחוץ תאי B Ag מחייב אפילו נדיר; (ii) אסטרטגיה המגביל המשתמשת שלושה Ag tetramers (שני רלבנטיות, אחד לא רלוונטי) מתויג עם שלושה fluorochr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים המתקן Cytometry “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, נאנט) לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים גם כל הצוות של ייצור חלבון רקומביננטי (P2R) ושל ההשפעה פלטפורמות (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, נאנט) לתמיכה טכנית שלהם. אנו מודים עמנואל Scotet, ריצ’רד Breathnach להערות בונה על כתב היד. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הפרויקט IHU-צ’סטי במימון התכנית ממשלת צרפת «Investissements d’Avenir», מנוהל על ידי הצרפתי הלאומי מחקר סוכנות (ANR) (ANR-10-IBHU-005). פרויקט IHU-צ’סטי נתמך גם על ידי נאנט Métropole Région פיי דה לה לואר. עבודה זו מומש בהקשר של התוכנית LabEX IGO הנתמך על-ידי הסוכנות מחקר לאומי באמצעות ההשקעה של התוכנית בעתיד ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC
Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Play Video

Cite This Article
Devilder, M., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

View Video