Summary

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Published: February 06, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode pour la production d’anticorps humains spécifiques pour un antigène d’intérêt, à partir de rares cellules B circulant dans le sang humain. Génération de ces anticorps naturels est efficace et rapide, et les anticorps obtenus peuvent distinguer les antigènes fortement connexes.

Abstract

Anticorps monoclonaux (ACM) sont de puissants outils utiles pour les deux la recherche fondamentale et en biomédecine. Leur spécificité élevée est indispensable lorsque l’anticorps doit faire la distinction entre les structures fortement connexes (p. ex., une protéine normale et une version mutée de celle-ci). La façon actuelle de générer ces mAbs discriminatif implique une vaste sélection de multiples cellules productrices de Ab B, qui est coûteux et fastidieux. Nous vous proposons ici une méthode rapide et rentable pour la génération de discriminatoire, mAbs entièrement humain à partir de sang humain, les lymphocytes B circulants. L’originalité de cette stratégie est due à la sélection des cellules de liaison B antigène spécifique combinée à la Counter-sélection de toutes les autres cellules, à l’aide de facilement disponible Peripheral Blood mononucléaires cellules (PBMC). Une fois que les cellules B spécifiques sont isolés, cDNA (l’acide désoxyribonucléique complémentaire) séquences codant pour le mAb correspondant sont obtenus utilisant la technologie de cellule unique Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) et par la suite exprimé en homme cellules. Dans aussi peu que 1 mois, il est possible de produire des milligrammes de hautement discriminatoires mAbs humain dirigé contre pratiquement n’importe quel antigène désiré naturellement détectée par le répertoire des cellules B.

Introduction

La méthode décrite ici permet la production rapide et versatile de pleinement humains anticorps monoclonaux (ACM) contre un antigène désiré (Ag). mAbs sont des outils essentiels dans beaucoup de demandes de recherche fondamentale in vitro et in vivo: flow cytometry, histologie, expériences western-blot et blocage par exemple. En outre, mAbs sont utilisés plus en médecine pour traiter les maladies auto-immunes, cancer et de contrôler le rejet de greffe1. Par exemple, ACM anti-CTLA-4 et anti-PD-1 (ou anti-PD-L1) ont été récemment utilisés comme inhibiteurs de point de contrôle immunitaire cancer traitements2.

Le mAbs première ont été produit par les immunoglobulines (Ig)-sécrétant des hybridomes obtenus des cellules spléniques de souris immunisées ou de rats. Cependant, la forte réponse immunitaire contre ACM murin ou rat entrave leur utilisation thérapeutique chez l’humain, en raison de leur apurement rapide et l’induction probable d’hypersensibilité réactions3. Pour résoudre ce problème, des séquences de protéines animales du mAbs ont été partiellement remplacées par humain pour produire ce qu’on appelle anticorps chimériques de souris-humain ou humanisés. Toutefois, cette stratégie ne diminue que partiellement immunogénicité, tout en augmentant considérablement le coût et les délais de production. Une meilleure solution consiste à générer le mAbs humaine directement à partir de cellules B humaines et il existe plusieurs stratégies pour cela. L’un d’eux est l’utilisation de l’affichage bactériophage ou de la levure. Cela implique l’affichage variables domaines auprès d’une bibliothèque combinatoire d’aléatoire Ig humaine lourde et des chaînes de lumière sur les phages ou levures et effectuer une étape de sélection à l’aide de l’antigène spécifique d’intérêt. Un inconvénient majeur de cette stratégie est que les chaînes lourdes et légères sont aléatoirement associés, conduisant à une augmentation très importante de la diversité des anticorps générés. Les anticorps obtenus ne devraient pas correspondent à celles qu’induirait une réponse immunitaire naturelle contre une Ag particulier. En outre, le repliement des protéines humaines et modifications post-traductionnelles ne sont pas systématiquement reproduites chez les procaryotes ou même chez les levures. Une deuxième méthode de production de mAb humaine est l’immortalisation des cellules B humaines naturelles, par infection à virus Epstein – Barr ou expression des facteurs anti-apoptotique BCL-6 et BCL-XL4. Toutefois, cette méthode est applicable uniquement aux cellules B mémoire et est inefficace, exigeant que le dépistage des nombreux mAb immortalisées B cellules productrices d’identifier les clones mAb peu (ou pas) avec la spécificité antigénique désirée. La méthode est donc coûteuses et chronophages.

Un nouveau protocole a été décrite récemment pour la production du mAbs humaine de simple isolé de cellules B5. Elle s’appuie sur une optimisée unicellulaires Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour l’amplification des deux la lourds – et chaînes légères encodage des segments d’une seule cellule B triée. Il est suivi par le clonage et l’expression de ces segments dans un système d’expression eucaryote, permettant ainsi la reconstitution d’un mAb pleinement humain. Ce protocole a été utilisé avec succès à partir de cellules de B de donneurs vaccinés. Les cellules ont été récoltées plusieurs semaines après la vaccination pour obtenir des fréquences plus élevées des lymphocytes B dirigés contre le Ag souhaitée et de limiter ainsi le temps nécessaire pour le dépistage de6. Autres mAbs pleinement humaines ont également été produites de patients7 et mélanome les patients infectés par le VIH+ (Virus de l’immunodéficience humaine)8. Malgré ces avancées, toujours aucune procédure n’est disponible que permet l’isolement Ag spécifiques de cellules de B indépendamment de leur phénotype mémoire ou la fréquence.

La procédure décrite ici conduit à l’isolement efficace ex vivo de cellules B circulantes humaines fondée sur leur spécificité BCR, suivie par la production de pleinement humain mAbs antigène-spécifiques dans le rendement élevé et avec un temps de projection basse. La méthode ne se limite pas aux cellules B mémoire ou les cellules B sécrétant des anticorps induits après une immuno-réaction, mais peut également être appliquée pour le répertoire de cellules B naïves humaines. Qu’il fonctionne même à partir de cellules de B Ag spécifiques présents à très basses fréquences est une bonne indication de son efficacité. Le principe de la méthode est la suivante : les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont colorées avec deux tétramères présentant l’antigène d’intérêt, chacun marqué avec un fluorochrome différent (p. ex., phycoérythrine (PE) et Allophycocyanin (APC)), et un troisième tétramère présentant un antigène étroitement apparenté conjugué avec un fluorochrome tiers (p. ex., Brillant Violet 421 (BV421)). Pour enrichir pour cellules de liaison de l’antigène, les cellules sont ensuite incubées avec perles recouvertes d’anti-PE et Abs anti-APC et triés dans les colonnes de séparation cellulaire. La fraction de cellules APC PE+ + est sélectionnée, colorées avec une variété de mAbs spécifiques pour différents types de cellules PBMC permettre l’identification des cellules B et soumis à l’écoulement cytometry cellule Tri. Les lymphocytes B qui sont PE+ et APC+, mais brillant Violet, sont isolés. Cette étape sélectionne dans les cellules qui ne sont pas des cellules B ou ne se lient pas à l’antigène tétramères, mais faire un bind PE ou APC (ces cellules sera PE+ d’APC ou PE APC+) ou à la partie non-antigène des tétramères utilisé (ces les cellules seront BV421+). Cellules B pas très spécifiques pour l’épitope d’intérêt sont également Counter-sélectionnés à cette étape (ces cellules seront également BV421+). Ainsi, cette méthode peut purifier hautement spécifique B cellules exprimant des récepteurs de B-cellule (RCO) capables de distinguer les deux antigènes très étroitement apparentées. Des cellules de B spécifiques uniques sont recueillis dans des tubes et leurs ADNc amplifié par PCR Ig (complémentaires acides désoxyribonucléiques) cloné et exprimé par une lignée cellulaire humaine comme sécrétées IgG mAbs.

Comme une preuve de concept, cette étude décrit la génération efficace du mAbs humaine, qui reconnaît un peptide présenté par une classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-je) molécule et peut distinguer ce peptide et d’autres peptides chargés sur le même MHC-j’ai allèle. Même si le niveau de complexité de cette Ag est important, cette méthode (i) permet la récupération de rendement élevé du mAbs Ag spécifiques ; (ii) la production du mAbs capables de distinguer deux Ags structurellement proches. Cette approche peut être étendue aux patients vaccinés ou infectés sans aucune modification du protocole et a également déjà été implémentée avec succès dans un système de rat humanisé9. Ainsi, cette étude décrit une approche polyvalente et efficace pour générer des mAbs entièrement humains qui peut être utilisés en immunothérapie et de la recherche fondamentale.

Protocol

Tous les échantillons de sang périphérique humain proviennent de donneurs adultes anonymes après consentement éclairé, selon le Comité d’éthique local (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procédure PLER NTS-2016-08). 1. isolement des cellules mononucléaires de sang périphérique humain Remarque : Matériel de départ peut être du sang périphérique humain total ou échantillons de cytaphérèse. Échantillons ne soient pas plus de 8 h et comp…

Representative Results

À partir de PBMC de donneurs sains, ce présente projet la génération du mAbs humaine, qui reconnaît le peptide Pp65495 (Pp65, du cytomégalovirus humain) présentés par la classe complexe majeur d’histocompatibilité I (MHC-I) molécule HLA – A * 0201 () HLA-A2). Ces mAbs peuvent distinguer entre ce complexe et complexes qui représentent les autres peptides chargés sur le même MHC-I molécule. PBMC ont ét?…

Discussion

Le projet de protocole est une méthode puissante pour la production d’ACM humains directement à partir de cellules spécifiques Ag B circulant dans le sang. Il combine trois aspects importants : (i) l’utilisation d’un enrichissement magnétique tétramère-associés, qui permet une isolation ex vivo des cellules de B de liaison Ag même rares ; (ii) une stratégie de blocage qui utilise trois tétramères Ag (deux des plus pertinentes et un non pertinent) étiquetés avec trois fluorochromes différent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions la Cytometry Facility « CytoCell » (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) d’assistance technique d’experts. Nous remercions également tout le personnel de production de protéines recombinantes (P2R) et des plates-formes des IMPACT (INSERM 1232, Santé SFR, Biogenouest, Nantes) pour leur soutien technique. Nous remercions Emmanuel Scotet et Richard Breathnach pour des commentaires constructifs sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu financièrement par le projet IHU-Cesti, financé par le gouvernement Français « Investissements d’avenir », géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire. Ce travail a été réalisé dans le cadre du programme IGO LabEX pris en charge par l’Agence nationale de la recherche par l’intermédiaire de l’investissement du futur programme ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

HEK 293A cell line Thermo Fisher scientific R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by life technologies 21969-035 (+) 4,5g/L D-Glucose
0,11g/L Sodium Pyruvate
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X) Gibco by life technologies 31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA) PAA K45-001
Nutridoma-SP Roche 11011375001 100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 Ambion AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 Invitrogen by Life Technologies 15575-020
Fetal Bovine serum (FBS) Dominique Dutscher S1810-500
Ficoll – lymphocytes separation medium EuroBio CMSMSL01-01 density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate Invitrogen by Life Technologies S21388 premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate Invitrogen by thermoFisher scientific S32362 1mg/ml
2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin Biolegend 405225 conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor Miltenyi Biotec 130-042-302/130-090-976
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
CD3 BV510 BD horizon BD Pharmingen / BD Biosciences 563109 Used dilution 1:20
CD19 FITC BD Pharmingen / BD Biosciences 345788 Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 561116 Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5 BD Pharmingen / BD Biosciences 338440 Used dilution 1:50
7AAD BD Pharmingen / BD Biosciences 51-68981E (559925) Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer BD Biosciences
8-strip PCR tubes Axygen 321-10-061
Racks for 96 microtubes Dominique Dutscher 45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) Invitrogen by thermoFisher scientific 10777-019 qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free Gibco 10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer New England BioLabs S1316S 5.0 A260unit
Random hexamers Invitrogen by thermoFisher scientific N8080127 qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen by thermoFisher scientific 18080-044 qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase Promega M7805
dNTP Set, Molecular biology grade Thermo Scientific R0182 4*100umol
5LVH1 Eurofins ACAGGTGCCCACT
CCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH3 Eurofins AAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVL4_6 Eurofins CCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
5LVH5 Eurofins CAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers
3HuIgG_const_anti Eurofins TCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1 Eurofins GGGAATTCTCACA
GGAGACGA
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTACAGCAGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTACAGCTGCAGCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGACGGTGACCATTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6 Eurofins TGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2 Eurofins ATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk3 Eurofins CTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
5'LVk4 Eurofins ATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566 Eurofins GTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCT
GACATCCAGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACCCAGAC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20 Eurofins TTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1 Eurofins CTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATYTCCACCTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3 Eurofins GCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5 Eurofins GCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers
5'LVl1 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl2 Eurofins GGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl3 Eurofins GCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5 Eurofins GGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl6 Eurofins GTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'LVl7 Eurofins GGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5LVl8 Eurofins GAGTGGATTCTCA
GACTGTGGTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
3'Cl Eurofins CACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2 Eurofins CTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3 Eurofins CTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5 Eurofins CTGCTACCGGTTCTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6 Eurofins CTGCTACCGGTTCTTGGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8 Eurofins CTGCTACCGGTTCCAATTCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers
3'XhoICl Eurofins CTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense Eurofins GCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC
Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade MP Bio AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate Macherey Nagel 743.100.100
Enzyme Age I HF New England Biolabs R3552L 20000U/ml
Enzyme SalI HF New England Biolabs R3138L 20000U/ml
Enzyme Xho I New England Biolabs R0146L 20000U/ml
Enzyme BSIWI New England Biolabs R0553L 10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase Invitrogen by thermoFisher scientific 15224.017 100U (1U/ul)
2X YT medium Sigma Aldrich Y1003-500ML
Ampicillin Sigma Aldrich 10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification Macherey Nagel 740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent PolyPlus 101-40
Flat bottom96-well plate Falcon 353072
V-bottom 96-well plate Nunc/Thermofisher 055142
Nunc easy 175 cm2 flasks Nunc/Thermofisher 12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer eBiosciences 00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates Nunc/Thermofisher 44-2404-21 high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) BD Pharmingen / BD Biosciences 55788
TMB substrate BD Biosciences 555214
Streptavidin Sigma S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column GE Healthcare 17-0402-01
ÄKTA FPLC GE Healthcare 18190026
Superdex 200 10/300 GL column GE Healthcare 17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System BioRad 7880003

References

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

Play Video

Cite This Article
Devilder, M., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).

View Video