Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue
Summary
Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.
Abstract
Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono potenti strumenti utili per entrambi ricerca fondamentale e della biomedicina. Loro alta specificità è indispensabile quando l’anticorpo è necessario distinguere tra strutture altamente correlate (ad es., una proteina normale e una versione mutata della stessa). L’attuale modo di generare tali mAbs discriminativo coinvolge vasta selezione di più celle di produzione di Ab B, che è sia costoso e richiede tempo. Vi proponiamo qui un metodo rapido ed economico per la generazione di discriminante, mAbs pienamente umana, a partire da sangue umano fare circolare i linfociti B. L’originalità di questa strategia è dovuto la selezione delle celle di associazione B antigene specifico combinato con il Counter-selezione di tutte le altre celle, utilizzando prontamente disponibili Peripheral Blood mononucleari cellule (PBMC). Una volta specifici linfociti B sono isolate, sequenze di cDNA (complementare dell’acido deossiribonucleico) che codifica per il mAb corrispondente sono ottenute utilizzando tecnologia single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) e successivamente espresse in umani cellule. In meno di 1 mese, è possibile produrre milligrammi di mAbs umano altamente discriminante nei confronti di praticamente qualsiasi antigene desiderato naturalmente rilevato dal repertorio musicale delle cellule di B.
Introduction
Il metodo qui descritto consente la produzione rapida e versatile di pienamente umana gli anticorpi monoclonali (mAbs) contro un antigene desiderato (Ag). mAbs sono strumenti essenziali per molte applicazioni di ricerca fondamentale in vitro e in vivo: flusso cytometry, istologia, esperimenti di western blotting e blocchi per esempio. Inoltre, mAbs vengono utilizzati più in medicina per curare le malattie autoimmuni, il cancro e per controllare il rigetto di trapianto1. Ad esempio, mAb anti-CTLA-4 e anti-PD-1 (o anti-PD-L1) recentemente sono stati usati come inibitori di checkpoint immuni in cancro trattamenti2.
Il primo mAbs sono state prodotte da immunoglobulina (Ig)-secernendo ibridomi ottenuti dalle cellule spleniche di topi immunizzati o ratti. Tuttavia, la forte risposta immunitaria contro anticorpi monoclonali murini o ratto ostacola il loro uso terapeutico negli esseri umani, a causa della loro rapida clearance e il probabile induzione di reazioni di ipersensibilità3. Per affrontare questo problema, sequenze di proteine animali di mAbs sono stati parzialmente sostituiti da quelli umani per generare i cosiddetti anticorpi chimerici topo-umani o umanizzati. Tuttavia, questa strategia diminuisce solo parzialmente immunogenicità, aumentando sostanzialmente sia il costo e il tempo-scala di produzione. Una soluzione migliore è quello di generare anticorpi monoclonali umani direttamente da linfociti B umani e sono disponibili diverse strategie per questo. Uno di loro è l’uso del display dei fagi o lievito. Questo comporta la visualizzazione di domini variabili da una libreria combinatoria di Ig umana casuale pesanti e catene leggere su fagi o lieviti e realizzazione di un punto di selezione usando l’antigene specifico di interesse. Un grande svantaggio di questa strategia è che le catene pesanti e chiare sono casualmente associate, portando ad un aumento molto grande nella diversità degli anticorpi generati. Gli anticorpi ottenuti difficilmente corrispondono a quelli che deriverebbero da una risposta immunitaria naturale contro un particolare Ag. Inoltre, modificazioni post-traduzionali e ripiegamento di proteine umane non sono sistematicamente riproducibili nei procarioti o anche nei lieviti. Un secondo metodo di produzione di mAb umana è l’immortalizzazione dei linfociti B umani naturali, dall’infezione del virus Epstein – Barr o espressione dei fattori anti-apoptotico BCL-6 e BCL-XL4. Tuttavia, questo metodo è applicabile solo alle cellule di B di memoria ed è inefficiente, che richiede la selezione delle cellule di B immortalizzate mAb-producendo numerose per identificare i cloni di mAb pochi (se presente) con la specificità antigenica desiderata. Il metodo è così costoso e che richiede tempo.
Recentemente è stato descritto un nuovo protocollo per la produzione di mAbs umana da isolato singolo B cellule5. Essa si basa su un ottimizzato unicellulare Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per l’amplificazione di entrambi i pesanti – e della luce-catena codifica segmenti da una singola cellula B ordinata. Questo è seguito dalla clonazione e l’espressione di questi segmenti in un sistema di espressione eucariotico, permettendo così la ricostruzione di un mAb pienamente umana. Questo protocollo è stato usato con successo a partire da cellule B da donatori vaccinati. Le cellule sono state raccolte diverse settimane dopo la vaccinazione per ottenere frequenze più alte delle cellule di B dirette contro l’Ag desiderato e quindi limitare il tempo necessario per lo screening di6. Altri mAbs pienamente umana sono state prodotte anche da pazienti infetti da HIV+ (Virus dell’immunodeficienza umana)7 e melanoma pazienti8. Nonostante questi progressi, non c’è ancora nessuna procedura disponibile che permette l’isolamento di cellule B Ag-specifici indipendenti del loro fenotipo memoria o la frequenza.
La procedura descritta qui conduce all’isolamento efficiente ex vivo di cellule B circolanti umane basato sulla loro specificità BCR, seguita dalla produzione di pienamente umano mAbs antigene-specifiche nell’alto rendimento e con un tempo di proiezione bassa. Il metodo non è limitato a cellule B memoria o cellule B disecrezione indotte dopo una risposta immunitaria, ma può essere applicato anche al repertorio delle cellule di B ingenui umano. Che funziona anche a partire da cellule B Ag-specifici presenti a frequenze molto basse è una buona indicazione della relativa efficienza. Il principio del metodo è come segue: le cellule mononucleari di sangue periferico (PBMC) sono macchiati con due tetrameri che presentano l’antigene di interesse, ognuno etichettato con un fluorocromo diverso (ad es., ficoeritrina (PE) e Allophycocyanin (APC)), e un terzo tetramero presentando un antigene strettamente correlato coniugato con un fluorocromo terzo (ad es., Brillant Violet 421 (BV421)). Per arricchire per le cellule antigene-legante, le cellule sono poi incubate con perline rivestite con anti-PE e Abs anti-APC e ordinati in colonne di separazione delle cellule. La frazione di cellule APC PE+ + è selezionata, macchiato con una varietà di anticorpi specifici per diversi tipi di cellule PBMC permettere l’identificazione delle cellule di B e sottoposto al flusso cytometry ordinamento delle cellule. Cellule di B che sono PE+ e APC+, ma brillante viola–, sono isolate. Questo passaggio Counter-seleziona le celle che non sono le cellule B o non legarsi all’antigene tetramerized, ma associa al PE o APC (queste cellule saranno PE+ APC– o PE– APC+) o la parte non-antigene dei tetrameri utilizzato (questi le cellule saranno BV421+). Le cellule B non altamente specifiche per l’epitopo di interesse Counter-vengono selezionate anche in questa fase (queste cellule saranno anche BV421+). Pertanto, questo metodo può purificare altamente specifici linfociti B che esprimono recettori di cellule B (BCR) in grado di discriminare tra due antigeni molto strettamente correlati. Cellule B specifiche singole sono raccolti in provette e loro PCR-amplificato Ig cDNA (acidi desossiribonucleico complementari) clonato ed espresso da una linea cellulare umana come secrete IgG anticorpi monoclonali.
Come un proof of concept, questo studio descrive la generazione efficiente di mAbs umano, che riconosce un peptide ha presentato da una classe di complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I) molecola e in grado di discriminare tra questo peptide e altri peptidi caricati sullo stesso MHC-I allele. Anche se il livello di complessità di questa Ag è importante, questo metodo (i) permette il recupero di ad alto rendimento di Marazzi Ag-specifici; (ii) la produzione di anticorpi monoclonali in grado di discriminare tra due strutturalmente chiudere Ags. Questo approccio può essere esteso ai pazienti vaccinati o infetti senza alcuna modifica del protocollo e ha anche già stato implementato con successo in un ratto umanizzata sistema9. Quindi, questo studio descrive un approccio versatile ed efficiente per generare mAbs pienamente umano che può essere utilizzato nella ricerca di base e l’immunoterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo proposto è un metodo potente per la generazione di anticorpi monoclonali umani direttamente dalle cellule di B di Ag-specifici circolanti nel sangue. Essa combina tre importanti aspetti: (i) l’uso di un arricchimento magnetico tetramero-collegato, che permette un isolamento ex vivo di cellule B Ag-associazione anche rare; (ii) una strategia di gating che utilizza tre tetrameri di Ag (due più rilevanti e irrilevanti uno) etichettati con tre diversi fluorocromi per isolare, mediante citometria a fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la struttura Cytometry “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per assistenza tecnica. Ringraziamo anche tutto il personale di produzione di proteine ricombinanti (P2R) e di piattaforme di impatto (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) per il loro supporto tecnico. Ringraziamo Emmanuel Scotet e Richard Breathnach per commenti costruttivi sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto IHU-Cesti finanziato dal programma di governo francese «Investissements d’Avenir», gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de la Loire. Quest’opera è stata realizzata nell’ambito del programma LabEX IGO supportato dall’agenzia di ricerca nazionale tramite l’investimento del futuro programma ANR-11-LABX-0016-01.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
References
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
