Мультимодального Imaging подход на основе микро CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки фиброза блеомицин индуцированного легких у мышей
Summary
Мы описываем неинвазивные смешанных изображений подход, основанный на микро-CT и флуоресценции молекулярные томографии для продольной оценки модели фиброз легких мыши, вызванных двойной трахею инстилляции блеомицин.
Abstract
Идиопатического легочного фиброза (МГЛ) является фатальной легких заболевание, характеризующееся постепенного и необратимого уничтожения легкого архитектуры, которая вызывает значительное ухудшение в легочной функции и последующей смерти от дыхательной недостаточности.
Патогенез МГЛ в экспериментальных моделях на животных были индуцированных блеомицин администрации. В этом исследовании мы исследуем модель МГЛ как мышь, вызванных инстилляции блеомицин двойной трахею. Стандартный гистологические оценки, используются для изучения фиброз легких являются инвазивные процедуры терминала. Целью этой работы является для мониторинга фиброз легких через неинвазивные методы визуализации как флуоресцентные молекулярной томография (ДРМ) и микро-CT. Эти две технологии, проверяются с выводами Гистологическая картина может представлять революционный функциональный подход для Неинвазивный мониторинг в реальном времени тяжести заболевания МГЛ и прогрессии. Сочетание различных подходов представляет собой шаг вперед для понимания болезни МГЛ, где молекулярные события, происходящие в патологические состояния могут наблюдаться с ДРМ и последующие анатомические изменения можно контролировать с помощью микро-CT.
Introduction
Идиопатического легочного фиброза (МГЛ) — хроническое заболевание легких с постепенное уменьшение функции легких, к сожалению, часто со смертельным исходом в течение четырех лет диагноз1. Основные функции МГЛ внеклеточной матрицы осаждения и пролиферации фибробластов, но патогенез еще не полностью понял. Наиболее поддерживаемых гипотеза является, что несколько циклов легких травм вызывает разрушение альвеолярных клеток эпителия, что приводит к изменения мезенхимальных клеточного цикла распространения, преувеличенные накопление фибробластов и миофибробласты, и увеличение матрица производства. Посредников, участвующих в этих процессах, такие, как матрицы металлопротеиназ (MMPs) были обнаружены dysregulated в развитие фиброза в человека МГЛ или блеомицин индуцированного животных моделях. Неконтролируемого производства ММЗ приводит к несбалансированным коллаген осаждения в интерстиции легких и альвеолярного пространства, подражая аномальные рану ремонт1,2.
Одним из основных препятствий для обнаружения наркотиков и развития является наличие доступных мыши моделей, которые имитируют человека патогенеза и фенотип болезни. Различные агенты были использованы, чтобы побудить фиброз легких в животных моделях: облучение повреждения, администрация асбеста и кремнезема, администрация fibrinogenic цитокинов и блеомицин3,4; Однако блеомицин является наиболее используемым в мышей, крыс, морские свинки, хомячки, кролики5 или в крупных животных (нечеловеческих приматов, лошадей, собак и жвачных животных)6,7. Блеомицин является антибиотиком, сделанные бактерией Streptomyces verticillus8 и используется в качестве агента противораковых9. Легочный фиброз общий побочный эффект препарата и по этой причине, он используется в экспериментальных моделях на животных побудить легочного фиброза.
В легких, блеомицин индуцированного фиброза модели фиброзных поражениях происходят 14-21 дней после блеомицин администрации. В представленной работе мы использовали новый протокол побудить фиброз легких у мышей с двойной блеомицин трахею инстилляции. Блеомицин модель мыши очень много времени, потому что новые препараты должны оцениваться по установленным фиброзных поражениях и испытания, чтобы отличить их анти фиброзный эффект от противовоспалительным действием.
Биохимические определение содержания коллагена, морфометрических и гистологический анализ основывались на анализе mortem пост, ограничивая возможность следовать патогенез заболевания в то же самое животное. Хотя эти параметры были считается золотым стандартом для оценки фиброза, они не обеспечивают любой временной или пространственной распределение фиброзных поражения и исключает возможность исследовать процесс прогрессирования заболевания. 10
Недавно, неинвазивной визуализации технологии были применены к монитор сократимость Ремоделирование, воспаления и прогрессии фиброза в мышиных моделях: магнитно-резонансной томографии (МРТ), компьютерная томография микро (Micro-CT), флуоресценции молекулярной Томография (ДРМ) и биолюминесцентных (BLI)11,12,13,14,,1516,,1718,19 ,,2021. Мы предлагаем неинвазивная изображений подход для мониторинга продольно прогрессии фиброза легких ДРМ и микро-CT в разные время очки после блеомицин вызов22.
В создании и развитии фиброза участвуют многие пути, и не так много известно. Только глубокое понимание этих процессов может перевести на более лекарственных препаратов, которые могут передавать в клинику. Возможность продольно контролировать MMP активации по молекулярной томография флуоресценции сочетании для обнаружения изменений легких Паренхиматозный микро-CT может использоваться в будущем для доступа к клинической реакции на лечение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на многие исследовательские группы упором на разработке новых препаратов для лечения МГЛ на данный момент только два доступны для пациентов. Есть медицинские срочно найти более эффективные методы лечения7 , потому что только легких микротрансплантатов возможнос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Daniela Pompilio и Роберта Ciccimarra за технической помощью.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
