Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos
Summary
Descrevemos um não-invasivo multimodal de imagem abordagem baseada na Micro-CT e fluorescência molecular tomografia computadorizada para avaliação longitudinal do rato modelo fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal duplo da bleomicina.
Abstract
Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar fatal caracterizada pela destruição progressiva e irreversível da arquitetura do pulmão, que causa deterioração significativa na função pulmonar e subsequente morte por insuficiência respiratória.
A patogênese da IPF em modelos animais experimentais tem sido induzida pela administração de bleomicina. Neste estudo, investigamos um modelo IPF-como rato induzido por uma duplo intratraqueal instilação de bleomicina. Padrão histológicas Avaliações para estudar fibrose pulmonar são procedimentos invasivos de terminais. O objetivo deste trabalho é monitorar a fibrose pulmonar através de técnicas de imagem não invasivas, como tomografia computadorizada Molecular fluorescente (FMT) e Micro-CT. Essas duas tecnologias validadas com as conclusões de histologia poderiam representar uma abordagem revolucionária funcional para monitoramento invasivo em tempo real de progressão e severidade da doença IPF. A fusão das diferentes abordagens representa mais um passo para a compreensão da doença IPF, onde os eventos moleculares que ocorrem em uma condição patológica podem ser observados com a FMT e as subsequentes alterações anatômicas podem ser monitoradas por Micro-CT.
Introduction
Fibrose pulmonar idiopática (IPF) é uma doença pulmonar crônica, com diminuição progressiva das funções pulmonares que infelizmente muitas vezes fatal dentro de quatro anos de diagnóstico1. Os principais recursos do IPF são proliferação de fibroblastos e deposição de matriz extracelular, mas a patogênese não é ainda totalmente compreendida. A hipótese mais apoiada é que vários ciclos de lesões pulmonares causam a destruição das células epiteliais alveolares que leva à alteração da proliferação mesenquimal ciclo celular, exagerado acúmulo de fibroblastos e miofibroblastos, e produção de matriz aumentada. Mediadores envolvidos nestes processos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs) foram encontrados prejudicado no desenvolvimento de fibrose na IPF humana ou em modelos animais induzida por bleomicina. A produção descontrolada de MMP leva a uma deposição de colágeno desequilibrada dentro do interstício pulmonar e o espaço alveolar, imitando anormal ferida reparo1,2.
Um dos principais obstáculos para a descoberta de medicamentos e desenvolvimento é a disponibilidade de modelos de mouse acessível que imitam a patogênese humana e o fenótipo da doença. Diferentes agentes têm sido utilizados para induzir fibrose pulmonar em modelos animais: danos de irradiação, administração de asbesto e sílica, administração de citocinas fibrinogenic e bleomicina3,4; no entanto, bleomicina é a mais usada em ratos, ratos, cobaias, hamsters, coelhos5 ou em grandes animais (primatas não-humanos, cavalos, cães e ruminantes)6,7. Bleomicina é um antibiótico feito pela bactéria Streptomyces verticillus8 e é usada como um agente anticâncer9. Fibrose pulmonar é um efeito colateral comum da droga e por esta razão, é usado em modelos animais experimentais para induzir fibrose pulmonar.
Em modelos de fibrose pulmonar induzida por bleomicina, as lesões fibróticas ocorrerem 14-21 dias após a administração de bleomicina. No trabalho apresentado, usamos um novo protocolo para induzir fibrose pulmonar em camundongos por instilação intratraqueal de bleomicina duplo. O modelo do rato de bleomicina é muito demorado, porque novos medicamentos precisam ser avaliadas em lesões fibróticas estabelecidas e testada para distinguir seus efeitos antifibróticos de efeitos anti-inflamatórios.
Bioquímica determinação do teor de colágeno, morfométricas e análise histológica foram baseadas na análise de post mortem, limitando a possibilidade de acompanhar a patogênese da doença no mesmo animal. Apesar desses parâmetros considerados padrão ouro para avaliação de fibrose, eles não fornecem qualquer distribuição espacial ou temporal da lesão fibrótica e impede uma maneira de investigar o processo de progressão da doença. 10
Recentemente, as tecnologias de imagem não-invasivos foram aplicadas ao monitor remodelação de vias aéreas, inflamação e progressão da fibrose em modelos murino: ressonância magnética (MRI), Micro Tomography do computador (Micro-CT), fluorescência Molecular Tomografia computadorizada (FMT) e bioluminescentes (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Propomos uma abordagem de imagem não-invasivos para monitorar a progressão de fibrose pulmonar por FMT e Micro-CT em diferentes pontos de tempo após uma bleomicina desafiar22longitudinalmente.
Muitos caminhos estão envolvidos na criação e no desenvolvimento de fibrose, e não se sabe muito. Somente uma compreensão mais profunda destes processos poderia traduzir para mais alvos de drogas que podem transferir para a clínica. A capacidade de monitorar longitudinalmente ativação MMP por tomografia de fluorescência molecular acoplada para a detecção de alterações parenquimatosas pulmonares por Micro-CT pode ser usada no futuro para acessar a resposta clínica ao tratamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de muitos grupos de pesquisa se concentra no desenvolvimento de novos medicamentos para tratar o IPF, no momento apenas dois estão disponíveis para os pacientes. Há uma necessidade urgente de médica para encontrar mais eficazes terapias7 porque só pulmão transplantationis capaz de prolongar a sobrevivência de 4-5 anos26. O pré-requisito essencial para o desenvolvimento de novas drogas e medicina translacional é a disponibilidade de um modelo animal que imita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Dr. Daniela Pompilio e Roberta Ciccimarra para ajuda técnica.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
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