Een multimodale Imaging aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordeling van bleomycine-geïnduceerde Lung Fibrosis in muizen
Summary
Beschrijven we een niet-invasieve multimodale aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordelingvan de muismodel van lung fibrosis geïnduceerd door dubbele intratracheale instillatietest van bleomycine imaging.
Abstract
Idiopathische longfibrose (IPF) is een dodelijke longziekte, gekenmerkt door de geleidelijke en onomkeerbare vernietiging van Long architectuur, waardoor significante verslechtering in de longfunctie en daaropvolgende dood van respiratoire insufficiëntie.
De pathogenese van IPF in experimentele dierlijke modellen heeft zijn geïnduceerd door bleomycine administratie. In deze studie onderzoeken we een IPF-achtige muismodel geïnduceerd door een dubbele intratracheale bleomycine instillation. Standaard histologische evaluaties gebruikt voor het bestuderen van de Long-fibrose zijn invasieve terminal procedures. Het doel van dit werk is volgen lung fibrosis via noninvasive beeldvormingstechnieken zoals fluorescerende moleculaire tomografie (FMT) en Micro-CT. Deze twee technologieën gevalideerd met de bevindingen van de histologie kunnen vertegenwoordigen een revolutionaire functionele aanpak voor real-time niet-invasieve monitoring van IPF ziekte ernst en progressie. De fusie van verschillende benaderingen stap een verder voor het begrijpen van de IPF ziekte, waar de moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden in een pathologische aandoening kunnen worden waargenomen met FMT en de daaropvolgende anatomische veranderingen kunnen worden gecontroleerd door Micro-CT.
Introduction
Idiopathische longfibrose (IPF) is chronische longziekte met progressieve daling van longkanker functies die helaas vaak dodelijk is binnen vier jaar na de diagnose1. De belangrijkste functies van de IPF zijn afzetting van de extracellulaire matrix en fibroblast proliferatie, maar de pathogenese is nog niet volledig begrepen. De meest gesteunde hypothese is dat meerdere cycli van longkanker verwondingen leiden tot de vernietiging van de alveolaire epitheliale cellen die tot wijziging van de proliferatie van de mesenchymale celcyclus, overdreven accumulatie van fibroblasten en myofibroblasts leidt, en verhoogde matrix productie. Bemiddelaars bij deze processen betrokken zijn, zoals matrix metalloproteinasen (MMP) gevonden in fibrose ontwikkeling menselijke IPF of in diermodellen bleomycine-geïnduceerde dysregulated. De ongecontroleerde MMP productie leidt tot een onevenwichtige collageen depositie in de longen interstitium en de alveolaire ruimte, nabootsen van abnormale wond reparatie1,2.
Een van de belangrijkste belemmeringen voor Geneesmiddelenontwikkeling is de beschikbaarheid van toegankelijke Muismodellen die menselijke pathogenese en het fenotype van de ziekte na te bootsen. Verschillende agenten zijn gebruikt voor het opwekken van fibrose van de Long in diermodellen: bestraling schade, beheer van asbest en silica, beheer van fibrinogenic cytokines en bleomycine3,4; maar bleomycine is de meest gebruikte in muizen, ratten, cavia’s, hamsters, konijnen5 of in grote dieren (niet-menselijke primaten, paarden, honden en herkauwers)6,7. Bleomycine is een antibioticum dat is gemaakt door de bacterie Streptomyces verticillus8 en wordt gebruikt als een anti-kanker agent9. Longfibrose is een veelvoorkomende bijwerking van de drug en om deze reden, het wordt gebruikt in experimentele dierlijke modellen voor het opwekken van longfibrose.
De fibrotische letsels optreden in Long bleomycine-geïnduceerde fibrose modellen, 14-21 dagen na toediening van bleomycine. In het gepresenteerde werk gebruikten we een nieuw protocol voor het opwekken van fibrose van de Long in muizen door dubbele bleomycine intratracheale instillatietest. De muismodel van bleomycine is zeer tijdrovend, omdat nieuwe geneesmiddelen moeten worden beoordeeld op gevestigde fibrotische laesies en getest om te onderscheiden van hun anti-fibrotische effecten van anti-inflammatoire effecten.
Biochemische bepaling van collageen inhoud, morphometrical en histologische analyse waren gebaseerd op de postmortem analyse, beperking van de mogelijkheid om te volgen van de pathogenese van de ziekte bij hetzelfde dier. Hoewel deze parameters werden beschouwd als een gouden standaard voor de evaluatie van de fibrose, deed ze niet bieden van een tijdelijke of ruimtelijke verdeling van de fibrotische laesie en beletsel voor een manier om het proces van progressie van de ziekte te onderzoeken. 10
Onlangs, niet-invasieve imaging-technologieën zijn toegepast op de monitor airway remodelleren, ontsteking en fibrose progressie in lymfkliertest modellen: Magnetic Resonance Imaging (MRI), Micro Computer Tomografie (Micro-CT), moleculaire fluorescentie Tomografie (FMT) en bioluminescente (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 2120, ,. Stellen wij een niet-invasieve beeldvormende aanpak als u wilt controleren lengterichting lung fibrosis progressie door FMT en Micro-CT op verschillende tijdstippen na een bleomycine challenge22.
Vele trajecten zijn betrokken bij de oprichting en de ontwikkeling van fibrose, en is niet veel bekend. Alleen een dieper inzicht in deze processen kan vertalen naar meer drug targets die in de kliniek overdragen mag. De mogelijkheid om te controleren lengterichting MMP activering door fluorescentie moleculaire tomografie gekoppeld aan de detectie van Long parenchymal veranderingen door Micro-CT misschien in de toekomst worden gebruikt voor toegang tot de klinische respons op behandeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks vele onderzoeksgroepen zich te concentreren op de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van de IPF, op dit moment zijn slechts twee beschikbaar voor patiënten. Er is een dringende medische noodzaak om te vinden van meer effectieve therapieën7 omdat alleen Long transplantationis bekwaam om te overleven van 4-5 jaar26verlengen. De essentiële voorwaarde voor translationeel geneeskunde en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is de beschikbaarhe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Dr. Daniela Pompilio en Roberta Ciccimarra voor technische hulp.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
