ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

1. 透水性研究サンプルの準備 注: 透過計測とシミュレーションを確認するために agarose のゲルまたは皮膚モデルの栽培に基づく細胞マトリックス モデルで構成されるサンプルが使用されました。 Agarose のゲル (二重蒸留水) H2O の 10 mL の agarose 高分解能粉末の 0.2 g を溶解します。 ソリューションをミックスし、80 ° C に加熱8 分間温度を維持します。 96 ウェル膜挿入システム (4.26 mm 径) の膜に 28.6 μ L agarose のゲルを適用または使用 226 μ 12 よく膜挿入システム (直径 12 mm) (例えば、Transwell システム)。 ゲルが固化するまでに 10 分を待ちます。 コラーゲン ゲル注: 無菌条件の下ですべての手順を実行、ソリューションがコラーゲン ・ ゲルの重合を遅く氷の上に保持されます。 1 ml の 0.4% コラーゲン R ソリューション (ラット尾コラーゲン) のミックス 125 μ のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS)。 黄色から赤色に変わり、フェノールレッドの色まで 1 M NaOH (水酸化ナトリウム) (〜 6 μ L) でソリューションを滴定しなさい。 コラーゲン ・ ゲルをダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) + 10% 牛胎児血清 (FCS) の 125 μ L を加え、ピペット チップを慎重に混ぜます。 96 ウェル膜挿入システムまたは 12 ウェル膜挿入システムの 226 μ の膜にコラーゲン ・ ゲルの 28.6 μ L を適用します。 30 分 (37 ° C、5% CO2) インキュベーターでゲルを残します。 線維芽細胞とコラーゲン細胞モデル注: すべての手順は、無菌条件の下で実行されます。 実験の前に 5-7 日一次繊維芽細胞を準備します。DMEM + 細胞培養フラスコ (75 cm2) で 10 s と線維芽細胞を育成し、2-3 日毎に媒体を変更します。注: 実験のセットアップによって細胞の多数使用できます。 細胞培養用フラスコ (80% 合流) からメディアを取り出して、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL (培養フラスコ 75 cm2) で 2 回洗います。0.05% の 3 mL を加えてトリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、37 ° C で 3 分間インキュベート 表面から細胞をデタッチする培養用フラスコを軽くタップします。DMEM + 10 s の 3 mL の追加によって反作用を停止します。遠心管にソリューションを転送します。 (120 g) x 細胞懸濁液を遠心、上清を除去、DMEM + 10 s の 0.5 mL で細胞を再懸濁します。 セルをカウントし、0.5 × 106セル/mL の濃度に調整します。注: 次の手順は、コラーゲン ・ ゲルの重合を遅く氷で実行されます。 ミックス 125 μ HBSS 0.4% コラーゲン R 溶液 1 mL とします。 1 M NaOH でソリューションを滴定しなさい (〜 6 μ L) まで、フェノールレッドの色が黄色から赤に変化します。 細胞懸濁液を 125 μ l 添加 (DMEM 10 s + 0.5 × 106セル/mL) コラーゲン ゲルし、ピペットを慎重に混ぜて。 96 ウェル膜挿入システムまたは 12 ウェル膜挿入システムの 226 μ の膜にコラーゲン ・ ゲルの 28.6 μ L を適用します。 30 分 (37 ° C、5% CO2) インキュベーターでゲルを残します。 DMEM + 10 s の 75 μ L をゲルの表面適用、96 ウェル膜の受信機のプレートに 300 μ L がシステムを挿入します。12 ウェル膜挿入システム、受信板の表面と 1,846 μ L 590 μ L のボリュームを使用します。 細胞マトリックス モデル (空輸) の面からメディアを削除し、7 日間インキュベート細胞マトリックス モデルをさらに。下に 100 μ l の培地を使用し、毎日媒体を変更します。 コラーゲン HaCaT 細胞モデル注: すべての手順は、無菌条件の下で実行されます。 HaCaT を準備する前に、次の手順 5-7 日。DMEM + 細胞培養用フラスコ (75 mm2) で 5% の FCS HaCaT を育成し、2-3 日毎に媒体を変更します。注: 実験のセットアップによって細胞の多数使用できます。 フラスコからメディアを取り出して、10 mL (培養フラスコ 75 cm2) の PBS で 2 回洗います。0.05% の 3 mL を加えてトリプシン EDTA/37 ° C で 10 分間インキュベートし、DMEM + 10 s の 3 mL で反応を停止します。遠心管にソリューションを転送します。 (120 g) x 細胞懸濁液を遠心上清を削除し、DMEM + 10 s の 0.5 mL で細胞を再懸濁します。 セルをカウントし、0.5 × 106セル/mL の濃度に調整します。注: 次の手順は、コラーゲン ・ ゲルの重合を遅く氷で実行されます。 ミックス 125 μ HBSS 0.4% コラーゲン R 溶液 1 mL とします。 1 M NaOH でソリューションを滴定しなさい (〜 6 μ L) まで、フェノールレッドの色が黄色から赤に変化します。 コラーゲン ・ ゲルに DMEM + 10 s の 125 μ L を追加し、ピペット慎重に混ぜます。 96 ウェル膜挿入システムまたは 12 ウェル膜挿入システムの 226 μ の膜に細胞懸濁液の 28.6 μ L を適用します。 30 分 (37 ° C、5% CO2) インキュベーターでゲルを残します。 細胞懸濁液の 75 μ L をゲルの表面に適用し、300 μ L DMEM + 96 ウェル膜の受信機のプレートに 10 s の挿入システムを追加します。12 ウェル膜システムを挿入、DMEM + 受信機板 10 s の表面と 1,846 μ L 590 μ L 細胞懸濁液の量を使用します。 3 日間インキュベート細胞マトリックス モデル2 日後、媒体を交換します。 セル行列模型の表面からメディアを削除し、さらに 7 日間インキュベート細胞マトリックス モデル。下に 100 μ l の培地を使用し、毎日媒体を変更します。 線維芽細胞と HaCaT コラーゲン細胞モデル注: すべての手順は、コラーゲン ・ ゲルの重合を遅く氷の無菌条件の下で実行されます。1.3.5、ステップまで手順 1.3 で説明するように、線維芽細胞を準備し、後 HaCaT に従ってステップ 1.4 1.4.4 のステップまで日を準備します。 ミックス 125 μ HBSS 0.4% コラーゲン R 溶液 1 mL に。 1 M NaOH でソリューションを中和する (〜 6 μ L) フェノールレッドの色が黄色から赤紫に変わるまで。 DMEM から成る一次線維芽細胞細胞懸濁液を 125 μ l 添加 + 10 s + 0.5 × 106セル/mL コラーゲンにゲルし慎重に混ぜます。 96 ウェル膜挿入システムまたは 12 ウェル膜挿入システムの 226 μ の膜に細胞懸濁液の 28.6 μ L を適用します。 30 分 (37 ° C、5% CO2) インキュベーターでゲルを残します。 次に、ゲルの表面や 96 ウェルの膜挿入システムの受信機のプレート上に 300 μ L に DMEM + 10 s の 75 μ L を適用します。12 ウェル膜挿入システム、受信機板の表面と 1,846 μ L の体積 590 μ L を使用します。 37 ° C、5% CO2で 1 日間インキュベートします。 表面からメディアを削除し、0.5 × 106セル/mL と HaCaT 細胞懸濁液を追加します。ボリュームは、1.5.6 のステップの下で前に説明したと同じです。 3 日間インキュベート細胞マトリックス モデル2 日後、媒体を交換します。 セル行列模型の表面からメディアを削除し、さらに 7 日間インキュベート細胞マトリックス モデル。下に 100 μ l の培地を使用し、毎日媒体を変更します。注: この調査 3 ゲル/セル ・ モデルのサンプルは 12 ウェル膜挿入システムの作製した.96 ウェル膜システムを挿入、ゲル/細胞モデルの 6 サンプルを使いました。統計的手段 3 サンプルが一般的です。しかし、障害や細胞培養のための偏差はコラーゲン マトリックス モデル 96 ウェル膜挿入システムの実験のために期待されます。したがって、我々 はサンプルの大きい番号を選んだ。 2. 透水性膜研究挿入システム ドナー物質注: 2 つのフルオレセイン ナトリウム塩 (NaFl) が生成されます。 NaFl を H2O の 0.1 mg/mL と 0.01 mg/mL の濃度に溶かしてください。異なるフルオレセイン イソチオ シアン酸-メンブラン (FD) 4,000、10,000、20,000、40,000 g/mol の分子量は H2O 2 mg/mL の濃度に分解しました。Agarose のゲルと透過性実験 (図 1参照) のためのドナー物質としてこれらのソリューションを使用します。 コラーゲン細胞のモデルでは、セットアップ、DMEM + 水の代わりに 10 s とすべてのソリューションを準備します。注: は、ドナー物質の貯蔵液 (高濃度 x 10) を準備します。ドナー濃度のわずかな変化は透過性実験の結果に影響を与えます。 実験方法注: 透過性実験は 37 ° C、湿度 > 90% で実行されます。このパラメーターは、細胞の生存率を保証します。温度は拡散プロセスの影響を与える agarose のゲル、コラーゲン ・ ゲル、コラーゲン細胞モデルと実験で同じパラメーターを使用します。ブラケットのボリュームの情報は、12 ウェル膜挿入システムを指します。 96 – (または 12) よく膜を準備 agarose から成るバリア挿入システム (プロトコルの 1.1 を参照してください) をゲルまたはセルのモデル (1.2 〜 1.5 のプロトコルを見なさい) および蛍光ドナー物質。 準備の 1:10、1:20、希釈標準曲線を確立するためにドナー物質の 1:320、1: 160、ホームキット 1:40。300 μ L (1,846 μ L) 受信機板の 3 つ井戸におけるすべての希釈ピペットします。12 ウェル膜システム用受信機別プレートを挿入します。シリアルの希薄を使用同等濃度 [mg/mL] に測定された蛍光 [RFU] を変換します。 75 μ L (590 μ L) サンプル (agarose のゲルまたは細胞モデル) の上にドナーの物質と受容体物質の 300 μ L (1,846 μ L) を追加 (H2O または DMEM + 10 s) 受信機の板で (図 1参照)。注: は、膜内の液体の表面システムを挿入レシーバー プレートで静水圧を避けるために同じレベルを持っていることを確認します。 インキュベーターのシェーカーにシステム全体を転送します。均一な混合を達成するために振動を調整 (合計ストローク軌道が 1.5 mm、速度の調整の回転に関連しているレベル 3.5 で 〜 480 1/min) 拡散プロセスに影響を与える濃度勾配を避けるために。 蛍光定期的にすべての時間を決定します。蛍光を測定するには、空板膜挿入システムに転送し、蛍光プレート リーダーを使用して受信機を測定します。励起波長 485 nm と 535 の放出を使用して蛍光の nm。 5 時間の実験を実行します。注: 実験中に液体はシステム全体から蒸発します。蒸発はドナーとアクセプタ濃度を変更し、結果に影響を与えます。この効果は、5 h ですが考慮すべき実行時間の長い実行時間の場合無視されます。 透水係数の計算 標準曲線を確立するには、濃度とシリアルの希薄の蛍光をプロットし、データを線形回帰を実行します。 透過実験の蛍光データ濃度に変換するのに線形回帰直線の傾きを使用します。シミュレーションを目的として mol/m3の単位に変換します。 時間をかけて機能として濃度をプロットし、(図 2参照) データの線形セグメントを確立します。 この直線部分の傾きを決定し、次の式によると透水係数を計算 (図 2の例を参照してください)。ここ dcA/dt はアクセプタ側では、含まれる化学物質の濃度の経年変化 (斜面)。CDはドナー側の濃度P は透水係数;A は透過面と VAは受容体のボリューム。この同等化は Fick の最初の法律から派生したときのみ適用できます、CD » CA6,22。 注: ドナー濃度は、受容体の検出濃度よりはるかに高いする必要があります。これは実験のセットアップで確認されました。 3. シミュレーション 注: シミュレーションは COMSOL Multiphysics 5.1 で行われました。この基本的な知識を想定しています。拡散シミュレーションの次の前提条件を作られています: (a) H2O の物質の拡散係数はゲルと比較するとはるかに高い。この差を補うためには、シミュレーションは、2% アガロースゲル NaFl の拡散係数と比較して 100 に 10 の要因によってより高いですが 1 × 10-9 m2/s の値を使用します。(b) 実験では、物質は障壁を通って拡散し、膜の膜を通してシステムを挿入します。実験のセットアップと対照をなして仮想 agarose のゲルまたはセルのマトリックスと膜は 1 つの均質な相であることと見なされます。(c) 境界に及ぼす壁は「スリップ」壁すべての滑り効果に設定されます (液体とゲルや液体、細胞間ではなくモデル) の膜挿入システム無視し、拡散過程の重要ではないです。 拡散シミュレーションの設定注: これらの手順は、透過性実験のシミュレーションのセットアップを示してください。96 ウェルおよび 12 膜挿入システムのシミュレーションが個別にセットアップされました。「化学種輸送」モジュールは、拡散のフィックの第 2 法則に基づく数式を使用してください。c は物質の濃度、t は時間、u は速度、D は拡散係数、R は反応速度。拡散過程の化学反応が発生しなかったために、反応速度がなおざりにされていた。 プログラムを開くし、新しいモデルを開始します。選んだ選択 3 D モデル「モデル ウィザード」は、トランスポート希釈種」プルダウン ・ メニューで物理インターフェイスに「研究」をクリックして、「時間依存」のスタディを選択、”Done”をクリックしていますを追加します。 「グローバル定義」に移動し、右クリックで「パラメーター」を追加。グリッドで幾何学的および物理的なパラメーターを入力してください (表 1表 2、および図 3 eを参照)。注: 96 ウェル膜挿入システムに agarose のゲルの凹面の表面は、浸漬ボールで近似されました。 実験から膜挿入システムのジオメトリを設定します。ステップ 3.2 で 96 ウェル膜挿入システムの幾何学を構築する方法の例です。長さの単位を設定するメーター。注: 計算時間を節約する全体のジオメトリを作成しないこと。代わりに、ジオメトリはジオメトリの四分の一の中心線を使用して減らすことが (図 3aおよび図 3 bを参照)。 「定義」(右「定義」をクリックし「プローブ」を検索) に 2 つの「ドメイン プローブ」を追加しドナー ドメインとして他のアクセプター ドメインと 1 つのプローブを選択します。両方の「平均的」とユニット「mol/m3」式”c”タイプを選択します。注: この手順はオプションであり、シミュレーション中にアクセプタとドナーの濃度を示しています。 トランスポート プロパティ 1」で”希薄化後種””Dif_w”の輸送における拡散係数 (Dc) を設定.メモ:「トランスポート プロパティ 1」は、アクセプタとドナーの両方のドメインに対して使用されます。次の手順でバリア ドメインが上書きされます。 「希釈種の輸送」の 2 番目の「トランスポート プロパティ 2」を右クリックを追加し、「ドメインの選択」でバリア (2) を選択します。シミュレーションの目的に応じて障壁の値またはダミー変数”D”として、拡散係数を設定できます。最初のテストの実行の 2E 10 m2/s の値を設定します。注:”D”は、ステップ 3.3 に後で宣言されます。 「トランスポートの希釈種」の「1「初期値ゼロとしての濃度の定義。注:「初期値 1」バリアとアクセプタのドメインに対して使用されます。次の手順では、ドナー ドメインが上書きされます。 「希釈種の輸送」の 2 番目の”初期値 2″を右クリックを追加し、ドメインとしてドナー (3) を選択します。ドナーの物質 (例えば表 2 から C_fl) の初期濃度濃度を設定します。 「希釈の種の輸送」の上で右クリックで「対称 1」を追加追加、全体の形状を反映した「境界選択」のすべての表面を選択 (3.2 でジオメトリの例、それは境界番号 1、2、4、5、7、8)。注: 全体の形状が設定されている場合は、この点を無視できます。 「メッシュ」上で右クリック 2 つ”無料四面体」を追加します。ドメイン (「ドメイン」に変更ジオメトリ エンティティ レベル)、バリア (2) を選択します。上の右クリックで「サイズ」を追加「無料四面体 1″と定義済みのメッシュの”細かい”12 ウェル膜挿入システムまたは「極細」96 ウェル膜挿入システム。 挿入システムのドメインと 12 ウェル膜の定義済みメッシュ「普通」または「細かい」96 ウェル膜挿入システムはアクセプターと提供者にで、2 回目「無料四面体」選択 (図 3 の cと3 d の図を参照)。注: 計算時間を節約する粗いメッシュを選択することが可能ですも。これは、結果の精度を削減可能性があります。ジオメトリをメッシュに「メッシュ設定」で「すべてビルド」をクリックします。 「計算」でシミュレーションを開始、「研究 1」。 ジオメトリの設定例注: ここで例が (凹面関門) 96 ウェル膜挿入系のジオメトリを設定する方法のあります。すべての手順は、プログラムのジオメトリのモジュールで実行されます。長さの単位を設定するメーター。 D_w/2 と h_a + 硬度 h_sp の高さの半径を持つシリンダー 1 (「幾何学 1」上で右クリック) を生成します。 D_tran/2、h_sp の硬度 + h_a、および z 位置の高さの半径を持つシリンダー 2 を生成します。 「違い」オプションを使用して (上で右クリック「ジオメトリ 1″、「ブール値、パーティション」を検索) シリンダー シリンダー 1 から 2 を減算します。「オブジェクトを追加する」を選択”cyl1″は、「オブジェクトを減算する」をアクティブにし、、”cyl2″を選んだ。新しいボリュームは、受容体のジオメトリです。 D_a/2 の半径は、硬度の高さ、h_sp の位置の z のシリンダー 3 を生成します。 半径 r および z 位置のヘイズの球 1 を生成します。 シリンダー 3 (cyl3) から球 1 (sph1) を減算するのに「違い」オプションを使用します。新しいボリュームが違い 2 と呼ばれます。 D_a/2 の半径、ホブ切歯車 + h_a の高さの 4 シリンダーを生成し、h_sp の z を配置します。 「違い」オプションを使用して、違い 2 からシリンダー 4 (cyl4) を減算。新しいボリュームは、受容体のジオメトリです。 バリア (agarose ゲルまたはセルのモデル実験) を構築する手順 3.2.4-3.2.6 を繰り返します。 (右の「幾何学 1」をクリックして検索「ブール値、パーティション」) すべてのジオメトリ要素の連合 1 を作る。 1 d_tran の長さに設定すべてのエッジを持つブロックを生成 * 2 の位置の – d_tran と d_tran の y x * 2。 D_tran のすべてのエッジの長さと 2 ブロックを生成 * 2、位置 x – d_tran * 2 と d_tran の y。 連合 1 ブロック 1 からを減算し、2 をブロックする「違い」オプションを使用します。 パラメーター最適化をシミュレーションに追加します。注: パラメーター最適化の助けを借りて、拡散係数は前回作成した実験的データに装着可能します。拡散シミュレーションに最適化の一部を統合する方法を次に説明します。拡散シミュレーションは、次の手順を開始する前に動作確認します。 「最適化」「下剤を追加”を使用しての物理モジュールを追加 (最適化については、カテゴリ「最適化と感性」で「数学」で見つけることが) シミュレーション。「コンポーネントの追加」をクリックします。 「変数」との「定義」(コンポーネントのローカル) を右クリックして、表 3から変数の型を追加します。注: パラメーターの最適化を使用して、実数値、すなわち、拡散係数の要因 1-10を別個に定義する必要があります。 オペレーター名「アクセプタ」で「定義」「結合コンポーネント」セクションでの種類を右クリックで「平均 1」を追加。 実験データを含む別のテキスト ドキュメントを生成します。メモ: セミコロンで区切ります列;改行は行を分離します。時間宣言は秒単位 mol/m3の濃度で測定されます。最初を削除し、2 番目のデータ ポイント遅れ位相で (図 2を参照) できるエラーを回避する実験。ここでは、テキスト ドキュメントのようになりますどのように例です。3540;     0.002167140;     0.0072412240;   0.0170715180;   0.0223018660;   0.0269721540;   0.02931この例は、シミュレーションをテストする使用できます。 「グローバル最小二乗目的」右クリックで「最適化」を追加、「実験データ」にステップ 3.3.4 からテキスト ドキュメントを添付として最初の列を定義する”時間列 1″ を右クリックして”世界最小二乗目的”ととして 2 番目の列「列 1 の値」と「世界最小二乗目的」右クリックします。「列の値」の中の「表現」は、変数の”C”を入力します。 「グローバル コントロール変数 1」と「最適化」を右クリックし、初期値”1″、下限値「0」上限「1000」と変数として宣言して”D_search”を追加します。 追加右クリックで「最適化」「研究 1」と最適化ソルバーのメソッドとして”SNOPT”を選んだ。1E 9 に最適性許容値を設定します。注: シミュレーションが収束しなかった場合は、最適性トレランスを向上します。シミュレーションは最適性許容値が大きすぎる場合は正確なことに注意してください。 「研究」で「計算」とパラメーターの最適化を開始します。”D”として障壁の拡散係数を設定することを忘れないでください。