JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Een methode voor de bepaling en simulatie van permeabiliteit en verspreiding in een Model van 3D weefsel in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen

Published: February 23, 2018
doi:
10.3791/56412
, , , , , , ,
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering,Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology,Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

Summary

Een methode voor de bepaling van de permeabiliteit in een membraan invoegen systeem voor multi goed platen en in silico parameter optimalisatie voor de berekening van diffusie coëfficiënten met behulp van de simulatie worden gepresenteerd.

Abstract

In vitro gekweekt de modellen van de huid steeds relevanter voor farmaceutische en cosmetische toepassingen zijn geworden, en worden ook gebruikt in de Geneesmiddelenontwikkeling, alsmede het testen van de stof. Deze modellen worden vooral geteeld in membraan-insert systemen, hun permeabiliteit naar verschillende stoffen wordt een essentiële factor. Toegepaste methoden voor de bepaling van deze parameters vergen doorgaans, gewoonlijk grote steekproeven (b.v., Franz diffusie cel) of moeizaam apparatuur (bijvoorbeeld, fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP)). Deze studie geeft een methode voor het bepalen van de permeabiliteit coëfficiënten rechtstreeks in systemen van de membraan-invoegen met diameter grootte van 4,26 en 12.2 mm (teeltoppervlak). De methode werd gevalideerd met agarose collageen gels alsmede een collageen cel model vertegenwoordigt modellen van de huid. De processen van de permeatie van stoffen met verschillende moleculaire grootte en Permeatie door andere cel modellen (bestaande uit collageen gel, fibroblast en HaCaT) werden nauwkeurig beschreven.

Bovendien, ter ondersteuning van de bovengenoemde experimentele methode, een simulatie opgericht. De simulatie past de experimentele gegevens goed voor stoffen met kleine moleculaire omvang, omhoog tot 14 x 10-10 m Stokes straal (4.000 MW), en daarom is een veelbelovend instrument voor het beschrijven van het systeem. Bovendien, de simulatie experimentele inspanningen aanzienlijk kan verminderen en is robuust genoeg om te worden verlengd of aangepast aan meer complexe opstellingen.

Introduction

Organo-typische 3D culturen zijn krachtige hulpmiddelen voor Geneesmiddelenontwikkeling en stof testen1geworden. In dit opzicht zijn de modellen van de menselijke huid van bijzonder belang als gevolg van wettelijke voorschriften, zoals die in de cosmetica-industrie. Zij hebben vervolgens geleid tot de ontwikkeling van talrijke 3D huid modellen, voor gebruik op hun eigen als single-orgel-culturen in multi goed platen of in multi-organ-chips in combinatie met extra orgel modellen, bijvoorbeeld, de lever2.

Met betrekking tot de teelt van een simulatie van de huid is de lucht-vloeistof-interface (ALI) een essentieel element voor goede epidermale differentiatie3. Cel cultuur inzetstukken bestaat uit een schip met een vloeistof-permeabel membraan aan de onderkant worden meestal gebruikt om een ALI. ALIs worden algemeen gebruikt in de handel verkrijgbare huid modellen zoals EpiDerm4, Phenion5, en Episkin6, voor de cultuur van de modellen van de huid met maten van 96-Wells (4,26 mm diameter) tot 12-well (12.2 mm diameter) platen. De hier beschreven methode bepaalt de permeatie van stoffen in een membraan invoegen systeem.

De permeabiliteit coëfficiënt is een belangrijke parameter voor de evaluatie van de kwaliteit van alle gekweekte huid-model ten opzichte van inheemse huid5, en wordt gebruikt om te beoordelen hoe snel werkzame stoffen migreren via de huid. Vooral als drugs of cosmetica producten worden toegepast op de huid moeten, is deze parameter essentieel om te begrijpen wanneer precies de actieve agenten langs komen. Een simulatie verder kan helpen te voorspellen van het gedrag van het systeem en vervolgens om de nodige experimentele tijdrovende inspanning, vooral wanneer een groot aantal stoffen is betrokken.

De Franz diffusie cel is state-of-the-art voor permeatie met de huid experimenten en de huid5,6,,7,,8,9 modellen. Dit apparaat bestaat uit twee compartimenten met een vaste monster (diffusie barrier) tussendoor. De te onderzoeken stof rechtstreeks wordt aangebracht op de bovenkant van het monster (donor compartiment) en de concentratie van de stof doordringen op het tegenovergestelde (acceptor) compartiment kan worden gedetecteerd. Aan de kant van de acceptor, worden constante temperatuur en homogene stof concentratie gewaarborgd door een kamer temperatuur en een magneetroerder. Monsters kunnen aan de kant van de acceptor van de Franz-cel een arm van de bemonstering worden onttrokken. Met een hoogtebereik tussen 19 cm en 179 cm is dit systeem relatief grote10,11. Een andere methode voor de bepaling van de coëfficiënten van de verspreiding in gel-achtige stoffen en weefsels is FRAP. Deze techniek maakt gebruik van het beginsel van bleken fluorescently label deeltjes in de gel en het vervolgens bepalen de hersteltijd van de gebleekte ruimte voor het berekenen van de diffusie coëfficiënt12,13,14.

Fourier-transformatie-infrarood (FTIR) spectroscopie, kan bovendien, om te bepalen van het proces van de permeatie van stoffen in de huid15,16te detecteren particle beweging met infrarood lichtabsorptie te worden gebruikt. Echter moeten deze of andere beeldvormende methoden (bijvoorbeeld, twee-foton fluorescentie correlatie spectroscopie17) intensieve instrumenten kosten.

In dit artikel wordt wordt een methode uitgereikt aan direct maatregel de permeabiliteit van een barrière binnen een membraan invoegen systeem, waar een huidmodel mag worden verbouwd. Deze methode kan permeabiliteit experimenten uitgevoerd worden met een groot aantal kleine steekproeven (goed formaat omhoog tot 4,26 mm) in een compact systeem. Dit is in tegenstelling tot de Franz diffusie cel, waar een afzonderlijk apparaat nodig is voor elke sonde, die moet worden gemonteerd op het apparaat en is moeilijk te realiseren voor kleine steekproeven (grootte van 4,26 mm). Bovendien, aangezien de methode vereist geen grote instrumentatie (bijvoorbeeld, een Microscoop confocal of multiphoton), een vermindering van zowel tijd als kosten wordt bereikt.

Alle de experimenten werden uitgevoerd in microporeuze membraan invoegen systemen met een steekproef (barrier) bestaande uit agarose gel of een vastgesteld op het membraan van collageen cel model. Fluorescerende stoffen (donor) met verschillende moleculaire maten werden toegepast op de bovenkant van het monster en de concentratie van doordrongen stof is aangetroffen op de bodem (acceptor) met behulp van een fluorescentie-afleesapparaat (Zie Figuur 1). Om de methode te valideren en testen van de nauwkeurigheid van deze simulatie, werden agarose gels geproduceerd en gebruikt als een barrière. Hydrogels worden gewoonlijk gebruikt voor het onderzoek van diffusie en permeatie processen in poreus medium in de biologische wetenschappen13. De methode werd vervolgens getest in een cel-geplaatste systeem dat bestaat uit een matrix van collageen van primaire fibroblasten en menselijke volwassen lage Calcium hoge temperatuur keratinocyten (HaCaT) cellen (model van de cel-matrix), dat een vereenvoudigde huid model18,19 is .

Bovendien was de permeatie-proces door middel van stroom simulaties met computationele vloeistofdynamica gesimuleerd. Het bleek dat door middel van de parameter optimalisatie, de coëfficiënt van de verspreiding kan worden berekend op basis van de experimentele gegevens. In het algemeen, biedt deze simulatie verschillende toepassingen; bijvoorbeeld, is het mogelijk om te voorspellen een permeatie proces op basis van korte experimenten en de simulatie kan aanzienlijk verminderen het aantal experimenten.

Experimentele methode en simulatie werden ontworpen voor toepassing op een orgel-on-a-chip systeem1,20,21, specifiek de 2-orgel-chip (2-OC) ontwikkeld commercieel1,22, 23,24,25. In principe kan het proces van de permeatie van elk orgel-model op basis van membraan invoegen systemen worden beschreven op deze manier.

Protocol

1. voorbereiding van het monster van permeabiliteit Studies Opmerking: Om te verifiëren permeatie metingen en simulaties, werd een steekproef bestaande uit agarose gel of een cel matrix model gebaseerd op de teelt van het huidmodel gebruikt. Agarose gel Los 0.2 g agarose hoge resolutie poeder in 10 mL H2O (tweemaal gedestilleerd water). Meng de oplossing en verwarmen tot 80 ° C. Handhaving van de temperaturen gedurende 8 minuten. 28.6 µL agarose gel van toepassing op het membraan van de 96-Wells membraan invoegen systeem (4,26 mm diameter) of gebruik 226 µL voor de 12 goed membraan invoegen systeem (12 mm diameter) (b.v., Transwell systeem). Wacht 10 minuten tot de gel is gestold. Collageen gelOpmerking: Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden en de oplossingen worden gehouden op het ijs te vertragen de polymerisatie van de collageen-gel. Mix-125 µL van Hanks evenwichtige zout oplossing (HBSS) met 1 mL van 0.4% collageen R-oplossing (collageen van de staart van de rat). Titreer de oplossing met 1 M NaOH (natriumhydroxide) (~ 6 µL) tot de kleur van fenol rood verandert van geel naar rood. 125 µL van Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) toevoegen aan de collageen-gel en meng zorgvuldig met een pipet tip. 28.6 µL van collageen gel van toepassing op het membraan van het membraan van de 96-Wells invoegen systeem of 226 µL van het systeem 12-well membraan invoegen. Laat de gel in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten. Collageen cel model met fibroblastOpmerking: Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Het bereiden van primaire fibroblasten 5-7 dagen voor het experiment. Cultiveren van de fibroblasten met DMEM + 10% FCS in cel cultuur kolven (75 cm2) en het medium elke 2-3 dagen wijzigen.Opmerking: Afhankelijk van de experimentele opstelling, een groter aantal cellen kan worden gebruikt. Verwijder het medium van de cel cultuur kolf (80% heuvels) en spoel tweemaal met 10 mL (cultuur kolf 75 cm2) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 3 mL van 0,05% trypsine / ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Tik zachtjes op de kolf cultuur om los van de cellen van het oppervlak te maken. Zet de reactie stop door toevoeging van 3 mL DMEM + 10% FCS. Breng de oplossing kwantitatief over in een centrifugebuis. Centrifugeren van de celsuspensie bij 120 x g, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 0,5 mL van DMEM + 10% FCS. Cellen tellen en pas bij een concentratie van 0,5 x 106 cellen/mL.Opmerking: De volgende stappen worden uitgevoerd op het ijs te vertragen de polymerisatie van de collageen-gel. Mix-125 µL van HBSS met 1 mL van 0.4% collageen R-oplossing. Titreer de oplossing met 1 M NaOH (~ 6 µL) totdat de kleur van fenol rood van geel naar rood verandert. Toevoegen van 125 µL celsuspensie (DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 cellen/mL) in het collageen gel en meng zorgvuldig met een pipet. Breng 28.6 µL van collageen gel op het membraan van het membraan van de 96-Wells invoegen systeem of 226 µL van het systeem 12-well membraan invoegen. Laat de gel in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten. 75 µL van DMEM + 10% FCS toepast op het oppervlak van de gel en 300 µL aan de plaat van de ontvanger van de 96-Wells-membraan invoegt systeem. Invoegen voor de 12-well-membraan systeem, gebruikmaakt van een volume van 590 µL voor de µL van het oppervlakte- en 1,846 voor de ontvanger plaat. Verwijder het medium van het oppervlak van de cel matrix model (air lift) en de cel matrix model verder Incubeer gedurende 7 dagen. Gebruik 100 µl medium op de bodem en veranderen het medium elke dag. Collageen cel model met HaCaTOpmerking: Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Voorbereiden van de HaCaT 5-7 dagen vóór de volgende stappen uit. Cultiveren van de HaCaT met DMEM + 5% FCS in een cel cultuur kolf (75 mm2) en het medium elke 2-3 dagen wijzigen.Opmerking: Afhankelijk van de experimentele opstelling, een groter aantal cellen kan worden gebruikt. Verwijder het medium van de kolf en spoel tweemaal met 10 mL (cultuur kolf 75 cm2) van PBS. Voeg 3 mL van 0,05% trypsine/EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Stop de reactie met 3 mL van DMEM + 10% FCS. Breng de oplossing kwantitatief over in een centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 120 x g, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 0,5 mL van DMEM + 10% FCS. Cellen tellen en pas bij een concentratie van 0,5 x 106 cellen/mL.Opmerking: De volgende stappen worden uitgevoerd op het ijs te vertragen de polymerisatie van de collageen-gel. Mix-125 µL van HBSS met 1 mL van 0.4% collageen R-oplossing. Titreer de oplossing met 1 M NaOH (~ 6 µL) totdat de kleur van fenol rood van geel naar rood verandert. 125 µL van DMEM + 10% FCS toevoegen aan de collageen-gel en zorgvuldig mengen met een pipet. Breng 28.6 µL celsuspensie op het membraan van het membraan van de 96-Wells invoegen systeem of 226 µL van het systeem 12-well membraan invoegen. Laat de gel in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten. 75 µL celsuspensie van toepassing op het oppervlak van de gel en voeg 300 µL van DMEM + 10% FCS aan de plaat van de ontvanger van de 96-Wells-membraan systeem invoegen. Invoegen voor de 12-well-membraan systeem, gebruikmaakt van een volume van 590 µL celsuspensie voor de µL van het oppervlakte- en 1,846 van DMEM + 10% FCS voor de ontvanger plaat. De cel matrix model Incubeer gedurende 3 dagen; het wisselen van het medium na 2 dagen. Verwijder het medium van het oppervlak van het model van de matrix cel en de cel matrix model voor verdere 7 dagen uit te broeden. Gebruik 100 µl medium op de bodem en veranderen het medium elke dag. Collageen cel model met fibroblasten en HaCaTOpmerking: Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden op ijs te vertragen de polymerisatie van de collageen-gel. De fibroblasten bereiden zoals beschreven in stap 1.3 tot stap 1.3.5, en een dag later HaCaT zoals beschreven in stap 1.4 tot stap 1.4.4 te bereiden. Mix-125 µL van HBSS in 1 mL van 0,4% collageen R oplossing. Neutraliseren van de oplossing met 1 M NaOH (~ 6 µL) totdat de kleur van fenol rood van geel in een rode violet verandert. Voeg 125 µL van primaire fibroblast celsuspensie bestaande uit DMEM + 10% FCS + 0,5 x 106 cellen/mL tot de collageen gel en meng zorgvuldig. Breng 28.6 µL celsuspensie het membraan van het membraan van de 96-Wells invoegen systeem of 226 µL van het systeem 12-well membraan invoegen. Laat de gel in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 30 minuten. Vervolgens passen 75 µL van DMEM + 10% FCS op het oppervlak van de gel en 300 µL op de plaat van de ontvanger van de 96-Wells-membraan systeem invoegen. Invoegen voor de 12-well-membraan systeem, een volume van 590 µL wordt gebruikt voor de µL van het oppervlakte- en 1,846 voor de ontvanger plaat. Incubeer gedurende 1 dag bij 37 ° C en 5% CO2. Verwijder het medium uit het oppervlak en voeg een celsuspensie HaCaT met 0,5 x 106 cellen/mL. Het volume is het zelfde als voordien beschreef onder stap 1.5.6. De cel matrix model Incubeer gedurende 3 dagen; het wisselen van het medium na 2 dagen. Verwijder het medium van het oppervlak van het model van de matrix cel en de cel matrix model voor verdere 7 dagen uit te broeden. Gebruik 100 µl medium op de bodem en veranderen het medium elke dag.Opmerking: Voor dit onderzoek, 3 gel/cel-model monsters waren voorbereid op de 12-well membraan invoegen systeem. Invoegen voor de 96-Wells-membraan systeem, gebruikten we 6 monsters voor de gel/cell model. Voor statistische doeleinden zijn 3 monsters gemeenschappelijk. Maar voor de experimenten in het membraan van de 96-Wells invoegen systeem met collageen matrix model we storingen en deviaties voor de cultuur van de cel verwacht. Daarom kozen we voor een groter aantal monsters. 2. permeabiliteit Studies in het membraan invoegen systeem Donor stofOpmerking: Twee fluoresceïne natriumzouten daarvan (NaFl) worden geproduceerd. Ontbinden NaFl in H2O bij een concentratie van 0,1 mg/mL en 0,01 mg/mL. De verschillende fluoresceïne isothiocyanaat-dextranen (FD) met een molecuulgewicht van 4.000, 10.000, 20.000 en 40.000 g/mol worden opgelost in H2O met een concentratie van 2 mg/mL. Gebruik deze oplossingen als donor stof voor de experimenten van de permeabiliteit (Zie Figuur 1) met agarose gel. Voorbereiden voor de configuratie met de collageen cell model alle oplossingen met DMEM + 10% FCS in plaats van water.Opmerking: Bereiden stamoplossingen (10 x hogere concentratie) van de donor-stof. Kleine variaties van de concentratie van de donor kunnen invloed hebben op de resultaten van het experiment van de permeabiliteit. Experimentele methodeOpmerking: De permeabiliteit experiment is uitgevoerd bij 37 ° C en een luchtvochtigheid van > 90%. Deze parameter zorgt ervoor dat de levensvatbaarheid van de cellen. Temperatuur van invloed op de diffusie-proces dus dezelfde parameters worden gebruikt voor de experimenten met de agarose gel, gel van collageen en collageen cel model. Gegevens over de volumegrootte in de beugel verwijst naar de 12-well membraan invoegen systeem. Bereiden van een 96 – (of 12) goed membraan invoegen systeem met een barrière bestaande uit agarose gel (Zie Protocol 1.1) of cel model (Zie Protocol 1.2-1.5) en de fluorescentie donor stof. Maak verdunningen van 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 en 1:320 van de donor stof voor de vaststelling van een standaard curve. Pipetteer 300 µL (1,846 µL) van elke verdunning in drie putjes van de plaat van de ontvanger. Invoegen voor de 12-well-membraan systeem gebruik een aparte ontvanger plaat. De seriële verdunningen worden gebruikt om de gemeten fluorescentie [RFU] converteren naar de equivalente concentratie [mg/mL]. Voeg 75 µL (590 µL) van donor stof op de top van het monster (agarose gel of cel model) en 300 µL (1,846 µL) van de acceptor stof (H2O of DMEM + 10% FCS) in de plaat van de ontvanger (Zie Figuur 1).Opmerking: Zorg ervoor dat het oppervlak van de vloeistof in het membraan systeem invoegen en hetzelfde niveau hebben om te voorkomen dat de hydrostatische druk in de plaat van de ontvanger. Overdracht van het volledige systeem op een shaker in de incubator. Passen de schudden om homogeen mengen (totale slag baan is 1,5 mm, snelheid is aangepast niveau 3.5, die gerelateerd is aan een rotatie van ~ 480 1/min) om te voorkomen dat een gradiënt van de concentratie, die invloed op de diffusie-proces. Fluorescentie periodiek elk uur te bepalen. Voor het meten van de fluorescentie, breng het membraan invoegen systeem in een lege plaat en meten van de fluorescentie binnen de receiver met behulp van een afleesapparaat. Gebruik een golflengte van de excitatie van 485 nm en uitstoot van 535 nm voor fluoresceïne. Voer het experiment voor 5 h.Opmerking: Tijdens de experimenten, de vloeistof verdampt van het gehele systeem. De verdamping verandert de concentratie in de donor en de acceptor en invloeden van de resultaten. Dit effect is verwaarloosd in het geval van een lopende tijd van 5 h, maar voor langer lopende keer die dit moet worden beschouwd. Berekening van de coëfficiënt permeabiliteit De standaard curve, uitzetten van de fluorescentie van de seriële verdunningen ten opzichte van de concentratie en het uitvoeren van een lineaire regressie over de gegevens. De helling van de lineaire regressie gebruiken de gegevens van de fluorescentie van het experiment permeatie omzetten in concentratie. Met het oog op de simulatie, omzetten van eenheden in mol/m3. Uitzetten van de concentratie als functie na verloop van tijd, en stellen het lineaire segment van de gegevens (Zie Figuur 2). De helling van deze lineaire deel bepalen en het berekenen van de coëfficiënt van de permeabiliteit van de volgende vergelijking (Zie het voorbeeld in Figuur 2):waar dcA/ dt is de verandering van de concentratie van de stof binnen de acceptor kant na verloop van tijd (de helling); CD is de concentratie aan de kant van de donor; P is de permeabiliteit coëfficiënt; A de permeatie oppervlak is, enA = het volume van de acceptor. Deze vergelijking is afgeleid van de eerste wet van Fick en kan alleen worden toegepast wanneer CD » CA6,22. Opmerking: De concentraties in de donor moeten wel veel hoger dan de concentratie gedetecteerd in de acceptor. Dit werd geverifieerd bij de experimentele opzet. 3. simulatie Opmerking: De simulatie werd gedaan met COMSOL Multiphysics 5.1. Een basiskennis van dit wordt aangenomen. Voor de simulatie van de verspreiding, zijn de volgende veronderstellingen gemaakt: (a) de coëfficiënt van de verspreiding van de stoffen in H2O is veel hoger in vergelijking met die in de gel. Om te compenseren voor dit verschil, de simulatie gebruikt een waarde van 1 x 10-9 m2/s die hoger is met een factor 10 tot 100 vergeleken met de coëfficiënt van de diffusie van NaFl door 2% agarose gel. (b) in het experiment, de stof diffundeert door de barrière en voeg vervolgens via het membraan van het membraan systeem. In tegenstelling tot de experimentele opzet, de virtuele agarose gel of cel matrix en het membraan worden beschouwd als een homogene fase. (c) grens effecten op muren zijn ingesteld op “geen slip”, alle vertraging effect op muren (niet tussen vloeistof en gel of vloeistof en cel model) van het membraan invoegen systeem worden verwaarloosd en zijn niet significant voor het proces van verspreiding. Installatie van de diffusie-simulatieOpmerking: Deze stappen demonstreren de setup van de simulatie van de permeabiliteit experiment. De simulaties aan het eind van de 96 – en 12-well membraan invoegen: voorsystemen werden afzonderlijk instellen. De “Chemische soorten vervoer”-module gebruikt een vergelijking op basis van de tweede wet van Fick van verspreiding:waar c is de concentratie van de stof, t is de tijd, u is de snelheid, D is de diffusie-coëfficiënt en R is de reactiesnelheid. De reactiesnelheid is verwaarloosd, omdat er geen chemische reactie is opgetreden in het proces van verspreiding. Open het programma en start van een nieuw model. Koos de “Wizard Model”, selecteer het 3D-model, toevoegen “Vervoer of verdund Species” aan natuurkunde interface in het pull-down menu, klik op “Studie”, selecteer de “Tijd afhankelijk” studie, en klik op “Done”. Ga naar de “Global definities” en “Parameters” met rechtermuisklik toe te voegen. Voer de geometrische en fysieke parameters in het raster (Zie de 3e figuur, tabel 1en tabel 2).Opmerking: Het concaaf oppervlak van het agarose gel in een 96-Wells membraan invoegen systeem was worden benaderd door een onderdompeling bal. De geometrie van het membraan invoegen systeem opgezet van de experimenten. In stap 3.2 ziet u een voorbeeld van hoe het bouwen van de geometrie van het membraan van de 96-Wells invoegen systeem. De lengte-eenheid is ingesteld op meter.Opmerking: Maak niet de hele geometrie om berekening tijd te besparen. In plaats daarvan de geometrie kan worden verminderd door met behulp van een kwart van de geometrie regels center (Zie Figuur 3a en 3b van de figuur). Voeg twee “domein sondes” in “Definities” (rechts klik op “Definities” en zoek “Probe”) en selecteer een sonde als de acceptor-domein en de andere als het domein van de donor. Kies voor beide type ‘Gemiddelde’ en de uitdrukking “c” met de eenheid “mol/m3”.Opmerking: Deze stap is optioneel en de concentratie van de donor en acceptor tijdens de simulatie toont. Instellen van de diffusie-coëfficiënt (Dc) in “Vervoer eigenschappen 1” in “vervoer van verdund soorten”als “Dif_w”.Opmerking: “Vervoer eigenschappen 1” wordt gebruikt voor zowel donor als acceptor domein. In de volgende stap, worden het barrière-domein overschreven. Voeg een tweede “Vervoer eigenschappen 2” met rechts-klik op “Vervoer of verdund Species” en selecteer de barrière (2) in de “domein selectie”. Afhankelijk van de doelstelling van de simulatie kan de diffusie-coëfficiënt worden ingesteld als een waarde van het blok of als een dummy variabele “D”. Voor de eerste test run, stelt u een waarde van 2E-10 m2/s.Opmerking: “D” zal later in stap 3.3 te worden aangegeven. In “Vervoer of verdund Species” voor “initiële waarden 1” definiëren de concentratie als nul.Opmerking: ‘Initiële waarden 1’ wordt gebruikt voor barrière en acceptor domein. In de volgende stap, worden het domein van de donor overschreven. Toevoegen van een tweede “Initiële waarden 2” met rechts-klik op “Vervoer of verdund Species” en selecteer de donor (3) als het domein. Stel de concentratie als de beginconcentratie van de donor stof (bijvoorbeeld, C_fl uit tabel 2). “Symmetrie 1” met vlak tikken voort “Vervoer of verdund Species” toevoegen, toevoegen en kies alle oppervlakken van de “grens selectie”, die de hele geometrie spiegel (bijvoorbeeld de geometrie in stap 3.2 is het de grens nummer 1, 2, 4, 5, 7, 8).Opmerking: Dit punt kan worden verwaarloosd als de hele geometrie is ingesteld. Met een klik met de rechtermuisknop op “Mesh” toevoegen twee “gratis Tetrahedral”. Selecteer de barrière (2) als het domein (de geometrische entiteitsniveau wijzigen in “Domein”). “Grootte” toevoegen met rechts klikken op “gratis Tetrahedral 1” en voor de vooraf gedefinieerde Maas “Finer” voor de 12-well membraan invoegen systeem of “extra Fine” voor een 96-Wells-membraan invoegen systeem. In de tweede “gratis Tetrahedral” Selecteer de donor en acceptor zoals domein en de vooraf gedefinieerde mesh “Normaal” voor een 12-well membraan systeem invoegen of “Finer” voor een 96-Wells-membraan systeem invoegen (Zie Figuur 3 c en 3d figuur).Opmerking: Het is ook mogelijk om te kiezen een grovere gaas om berekening tijd te besparen. Hierdoor kan de nauwkeurigheid van de resultaten. Klik op “Bouwen alle” in “Mesh instelling” op het gaas van de geometrie. Start de simulatie met “berekenen” in de “Studie 1”. In het volgende voorbeeld setup voor een geometrieOpmerking: Hier wordt een voorbeeld gegeven van het instellen van de geometrie van het membraan van de 96-Wells invoegen systeem (met holle barrier). Alle stappen worden uitgevoerd in de module van de geometrie van het programma. De lengte-eenheid is ingesteld op meter. Het genereren van een cilinder 1 (Klik met de rechtermuisknop op “Meetkunde 1”) met straal van d_w/2 en de hoogte van de h_sp + h_b + h_a. Het genereren van een cilinder 2 met straal van d_tran/2, hoogte van h_b + h_a en z-positie van de h_sp. Gebruik de optie “Difference” (Klik met de rechtermuisknop op “meetkunde 1”, zoek “Booleans en partitie”) aftrekken van cilinder 2 van cilinder 1. Koos “cyl1” in de “objecten toe te voegen”, “Object aftrekken” activeren en koos “cyl2”. Het nieuwe volume is de geometrie van de acceptor. Het genereren van een cilinder 3 met straal van d_a/2, hoogte van h_b en z-positie van de h_sp. Het genereren van een bol 1 met straal r en z positie r_z. De optie “Difference” aftrekken gebied 1 (sph1) van de cilinder 3 (cyl3). Het nieuwe volume heet verschil 2. Genereren van een cilinder 4 met straal van d_a/2, hoogte van h_b + h_a, en z van h_sp plaats. De optie “Difference” aftrekken van cilinder 4 (cyl4) van verschil 2. Het nieuwe volume is de geometrie van de acceptor. Herhaal de stappen 3.2.4-3.2.6 om te bouwen van de barrière (het agarose gel of cel model in de experiment). Een Unie 1 alle geometrie-elementen (rechts klik op “Meetkunde 1” Zoek “Booleans en partitie”) maken. Genereren van een blok 1 met alle randen ingesteld op een lengte van d_tran * 2, positie x van – d_tran en y van d_tran * 2. Genereren van een blok 2 met alle rand lengte van d_tran * 2, positie x van – d_tran * 2 en y van – d_tran. Gebruik de “Difference”-optie wilt aftrekken van de Unie 1 van blok 1 en blok 2. De optimalisatie van de Parameter toe te voegen aan de simulatieOpmerking: Met behulp van de parameter optimalisatie de diffusie-coëfficiënt kan worden gemonteerd aan de eerder gegenereerde experimentele gegevens. De volgende instructies hoe de optimalisatie deel integreren de diffusie-simulatie. Controleer of dat de diffusie-simulatie werkt voordat u deze stappen begint. Toevoegen van de natuurkunde-Module “Optimalisatie” met behulp van “Toevoegen Physic” (optimalisatie kan worden gevonden in de “Wiskunde” in de categorie “Optimalisatie en gevoeligheid”) de simulatie. Klik op “Toevoegen aan de Component”. Voeg toe “Variabelen” met Klik met de rechtermuisknop onder “Definities” (lokaal in Component) en typ in de variabelen uit tabel 3.Opmerking: De parameter optimalisatie maakt gebruik van reële getallen, dat wil zeggen, de factor 1-10 van de diffusie-coëfficiënt moet afzonderlijk worden gedefinieerd. Voeg “Gemiddeld 1” met rechts klikken op ‘Definities’ in de sectie “Component koppeling” en type in de naam van de exploitant “Acceptor”. Het genereren van een aparte tekstdocument dat de experimentele gegevens bevat.Opmerking: Een puntkomma scheidt kolommen; een regeleinde gescheiden rijen. Verklaring van de tijd wordt gemeten in seconden, concentratie in mol/m3. Verwijderen van de eerste en tweede gegevenspunt in de fase van de vertraging (Zie Figuur 2) van de experimenten mogelijk montage fouten wilt vermijden. Hier is een voorbeeld hoe de tekstdocument eruit zou kunnen zien:3540;      0.002167140;      0.0072412240;    0.0170715180;    0.0223018660;    0.0269721540;    0.02931In het volgende voorbeeld kan worden gebruikt voor het testen van de simulatie. “Global kleinste kwadraten doelstelling” met rechts klikken op “Optimalisatie” toevoegen, de tekstdocument uit stap 3.3.4 toevoegen aan de “experimentele gegevens” en definiëren van de eerste kolom als “tijd kolom 1” met recht Klik op “De globale doelstelling van de kleinste kwadraten” en de tweede kolom als “Waarde van de kolom 1” met tikken vlak voort “De globale doelstelling van de kleinste kwadraten”. In de “expressie” van “De kolom van het waarde” Typ de variabele “C”. “Globale controle variabelen 1” met Klik met de rechtermuisknop op “Optimalisatie” en “D_search” declareren als een variabele met de aanvankelijke waarde “1” ondergrens “0” en de bovengrens “1000” toevoegen. Toevoegen “Optimalisatie” met rechts klikken op “Studie 1” en “SNOPT” als een optimalisatie Oplosser methode koos. Stel de optimaliteit tolerantie tot en met 1E-9.Opmerking: Als de simulatie niet convergeert, verhogen de optimaliteit tolerantie. Houd er rekening mee dat de simulatie verkeerde resultaten opleveren wanneer de optimaliteit tolerantie te groot is zal zijn. Start de parameter optimalisatie met “berekenen” in “studie”. Vergeet niet om in te stellen van de coëfficiënt van diffusie op de barrière als “D”.

Representative Results

Als een barrière werden uitgevoerd teneinde de juistheid van een simulatie, invoegen permeabiliteit experimenten in een 96-Wells-membraan systeem met 2% agarose gel. Fluoresceïne natriumzout (NaFl) en fluoresceïne isothiocyanaat-dextranen (FD) werden gebruikt om te controleren of de impact van de moleculaire grootte van de diffusing stof van 5 x 10-10 m tot aan 45 x 10-10 m Stokes straal (376.27-40.000 mol wt). De simulatie van native parameter optimalisatie werd gebruikt voor het passen van de simulatie tot experimentele gegevens. Te dien einde werden de hellingen van alleen de lineaire delen van de gesimuleerde permeabiliteit vergeleken met de experimentele resultaten. Voor de kleine moleculaire omvang waren simulatie en experimentele gegevens in goede overeenkomst met 99,2% voor NaFl en 80.2% voor 4000 FD (Zie figuur 4a en figuur 4b). Moleculaire groter gegenereerd hogere afwijkingen tonen correlaties van 50,5% voor FD 10.000 en 79,7% voor FD 20.000 53,6% voor FD 40.000. Kromme progressie in de simulaties bleek een vertraging bij het begin en een sterkere stijging van het verdere verloop van de grafieken (Zie Figuur 4 c-4e). Permeabiliteit coëfficiënten en gesimuleerde diffusie coëfficiënten worden weergegeven in tabel 4. De coëfficiënt permeatie afneemt met het verhogen van de moleculaire grootte. Standaarddeviatie was tussen 0.08 x 10-8 m/s en 0.47 x 10-8 m/s (N = 7), die overeenkwam met een absolute fout van 4,18% à 46.15%. Experimenten met grotere moleculen bleek een grotere absolute fout. De gesimuleerde diffusie coëfficiënten gedroeg zich zeer ook naar experimentele permeabiliteit coëfficiënten. Stoffen met een grotere Stokes straal toonde afnemende diffusie-coëfficiënten en de absolute fout varieerden tussen 9.09% en 18.46% (N = 3). In extra permeatie experimenten, waren vier verschillende collageen model celtypes gebruikt als barrières in de membraan van een 12-well systeem invoegen. Deze modellen bestaan uit een cel-vrij en een cel model met verschillende combinaties van primaire fibroblasten in de collageen-gel en HaCaT op het oppervlak. De volgende combinaties werden gebruikt: collageen (kolonel) als een cel-vrije model, collageen + fibroblasten (kolonel + F.), collageen + HaCaT (kolonel + H.), en collageen, fibroblasten + HaCaT (kolonel + F. + H.). Fluoresceïne natriumzout met DMEM + 10% FCS is als donor stof gebruikt. Voor beeld werd analyse van het collageen cel model, kleuring met haematoxyline en eosine (HE) gebruikt. Deze kleuring werd gedaan met behulp van de fabrikant-protocol. In Figuur 5, wordt dergelijke een vlek met een representatieve kolonel + F.h. +-model weergegeven. Hij kleurt licht de structuur van het weefsel van de collageen-matrix. De fibroblasten bevinden zich in de matrix en de kernen van de fibroblast en HaCaT cellen zijn gekleurd in de donker violet. Op de top van de collageen-matrix is er een laag met veel kernen, die de kernen van de HaCaTs moeten, het bouwen van een omhullende laag op de bovenkant van het model. In tabel 5, worden experimentele permeatie coëfficiënten en gesimuleerde diffusie coëfficiënten weergegeven. Een trend kan worden gezien voor de meeste van de modellen met HaCaT, die lagere permeatie/diffusie coëfficiënten in vergelijking met de modellen zonder HaCaT hebben. De absolute fout van de coëfficiënten permeatie is 10,9-24,4%, en voor de verspreiding coëfficiënten 5,2% – 12,9%. Figuur 1: zijaanzicht van de permeabiliteit experiment in een membraan invoegen systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: voorbeeld grafiek van een experiment van de permeabiliteit. De concentratie van de acceptor is uitgezet na verloop van tijd. Twee stippellijnen beugel het bijna lineaire deel van de grafiek. De helling van de lineaire deel wordt gebruikt voor het bepalen van de permeabiliteit coëfficiënt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: geometrie en mesh van het membraan systeem invoegen in de simulatie. (een) geometrie van de 96-Wells-membraan systeem invoegen. (b) geometrie van het membraan 12-well invoegen systeem. (c) Mesh van de 96-Wells-membraan invoegen systeem. (d) Mesh van de 12-well membraan invoegen systeem. (e) dwarsdoorsnede en parameters van het membraan invoegen systeem. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: vergelijking van de experimentele gegevens van een permeatie-experiment met de geoptimaliseerde simulatie. (een) natriumzout fluoresceïne, (b) fluoresceïne isothiocyanaat-dextran 4.000 mol pm, (c) 10.000 mol pm, (d) 20.000 mol pm en (e) 40.000 mol pm Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: vertegenwoordiger HE kleuring van een collageen cel model (fibroblasten, collageen + HaCaT). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: permeabiliteit coëfficiënt als een functie van de 1/Stokes straal met behulp van fluoresce¨ une natriumzout en fluoresceïne isothiocyanaat-dextran in een 96-Wells-membraan systeem invoegen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Naam Experession voor 96 goed systeem in mm Experssion voor 12-well systeem in mm Beschrijving d_tran 5,65 [mm] 14.7 [mm] Diameter van de put d_a 4.26 [mm] 12.1 [mm] Diameter van het membraan d_w 8.79 [mm] 21.97 [mm] Diameter van de Acceptor h_b 2 [mm] 2 [mm] Hoog van de barrière h_sp 1 [mm] 1 [mm] Afstand tussen goed en bodem h_a 4,73 [mm] 5.24 [mm] Hoog van de Acceptor b h_b/2 – Onderdompeling diepte r ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) – Straal van onderdompeling bal+ r_z r + h_b – z-positie van de onderdompeling bal+ Tabel 1: geometrie parameters voor “Chemische soorten vervoer” simulatie. + Alleen om te worden gebruikt voor de simulatie van agarose gel in 96 goed membraan invoegen systeem. Naam Expressie Waarde Beschrijving C_fl 0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] 0.26576 mol/m2 Concentratie van Fl.So. C_4 2 [mg/ml] / 4000 [g/mol] 0,5 mol/m2 Concentratie van FD 4.000 C_10 2 [mg/ml] / 10000 [g/mol] 0,2 mol/m2 Concentratie van FD 10.000 C_20 2 [mg/ml] / 20000 [g/mol] 0,1 mol/m2 Concentratie van FD 20.000 C_40 2 [mg/ml] / 40000 [g/mol] 0,05 mol/m2 Concentratie van FD 40.000 Dif_w 1e-9 [m ^ 2/s] 1e – 9m2/s Coëfficiënt van de diffusie van het mengen van water Tabel 2: Fysieke parameters voor “Chemische soorten vervoer” simulatie. Naam Expressie Beschrijving C Acceptor(c) Definitie van de acceptor-concentratie D D_search * 1e-10 Factor verandering voor D Tabel 3: Parameters voor de simulatie van de “Optimalisatie”. Doordringen Permeabiliteit coëfficiënt (m/s) x 10-8 Diffusie coëfficiënt (m/s2) x 10-10 Stokes straal van permeaatafsluiter (m) x 10-10 Fl.So. 4.79 ± 0,20 1.94 ± 0.34 5 FD 4.000 2.37 ± 0.31 0,65 ± 0.12 14 FD10, 000 1.67 ± 0.47 0,22 ± 0,02 23 FD 20.000 0,65 ± 0,30 0.29 ± 0,04 33 FD 40.000 0,27 ± 0.08 0,14 ± 0,02 45 Tabel 4: permeabiliteit en verspreiding coëfficiënt van stoffen met verschillende Stokes straal door middel van 2% Agarose gel + membraan in een 96-Wells-membraan systeem invoegen. (natriumzout fluoresceïne = Fl. So., fitc dextran = FD). Model Permeabiliteit coëfficiënt (m/s) x 10-8 Diffusie coëfficiënt (m/s2) x 10-10 Kolonel 2.18 ± 0,29 1,22 ± 0,06 Kolonel + F. 1.77 ± 0.38 0.93 ± 0.12 Kolonel + H. 1.64 ± 0.40 0.96 ± 0,05 Kolonel + F. + H. 1.65 ± 0.18 0.88 ± 0.11 Tabel 5: permeabiliteit en verspreiding coëfficiënt van fluoresceïne natriumzout door een collageen cel model in een 12-goed membraan invoegen systeem (kolonel = collageen, F. = Fibroblast, H. = HaCaT).

Discussion

Deze studie documenten een methode ontwikkeld om te kwantificeren Permeatie door middel van een weefsel-construct ontworpen op een membraan. Permeatie van stoffen met verschillende moleculaire maten door agarose gel werd eerst onderzocht om te testen en valideren van de methode en de bijbehorende simulatie. Het is algemeen bekend dat kleinere moleculen sneller via een matrix Maas (met uitzondering van het effect in gel filtratie door permeabiliteit chromatografie doordringen). Soortgelijke opmerkingen werden gemaakt met grootte-uitsluiting experimenten van stoffen door sclera26, menselijke epidermale membraan27, menselijke huid17en rat huid28. Een omgekeerde correlatie tussen permeabiliteit coëfficiënten en de bijbehorende Stokes straal (de straal van een harde bol die met hetzelfde percentage als de moleculen beschreven, meestal kleiner dan de effectieve straal van de molecule diffusie beweegt) is gebleken dat 26 , 28, en een gelijkaardige verhouding werd waargenomen in experimenten met stoffen van verschillende moleculaire grootte. Door het uitzetten van de permeabiliteit coëfficiënten over 1/Stokes straal, bleek een lineaire correlatie over de vier groepen met de kleinste moleculaire grootte (R2 = 0.93) (Figuur 6). Dit geeft aan dat gesimuleerde permeabiliteit coëfficiënten met de voorgestelde methode in een realistisch bereik.

De fout van 46.15% in de experimenten is iets groter dan voor permeabiliteit experimenten met de Franz diffusie cel systeem10gemeld. Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn de grootteverdeling van fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran, die later wordt besproken.

De beschreven methode heeft belangrijke voordelen in vergelijking met de methoden met behulp van het Franz diffusie cel systeem. Ten eerste is de opstelling compacter; de experimenten worden uitgevoerd direct in een systeem voor het invoegen van membraan, dat de omvang van een commerciële goed plaat (∼ 13 cm x 8,5 cm heeft). Hierdoor kunnen meerdere monsters tegelijk worden uitgevoerd terwijl Franz diffusie in een afzonderlijke cel is nodig voor elk monster. Ten tweede, de permeabiliteit van een huidmodel rechtstreeks kan worden gemeten in het membraan invoegen, waar de teelt plaatsvindt. Franz diffusie cuvetten, moeten de monsters worden genomen en gemonteerd op het systeem, dat meer belastend is voor de kleine monsters en is ook meer tijd in beslag.

Permeatie experimenten met collageen cel matrices toonde aan dat deze methode succesvol kan worden toegepast op cel-geplaatste systemen. De hier gepresenteerde model werd gecontroleerd voor de modellen van de huid; de methode kan echter worden toegepast op andere soorten organische celculturen, bijvoorbeeld, nier of lever.

In deze studie een collageen-cel model werd gebruikt waarin de HaCaT cellen volledig het modeloppervlak bedekt (Zie Figuur 5). Dit leidde tot een verlaging van de permeabiliteit coëfficiënt, waaruit blijkt dat de methode gevoelig genoeg is om te onderscheiden van de permeabiliteit coëfficiënt tussen een collageen-cel model met en zonder een laag van HaCaT. Idealiter een huidmodel moet opbouwen van een barrière, die de epidermis van een echte huid29 nadert, en daarom is het belangrijk om te controleren of de kwaliteit (bijvoorbeeld, de bouw van dermis, epidermis) van het huidmodel voor het werkelijke gebruik. De ontwikkeling van een huidmodel kan worden gevisualiseerd met kleuring technieken en gekwantificeerd bij de opsporing van huid eiwit en collageen30,31,32. De permeabiliteit coëfficiënt kan ook een belangrijke factor voor het beoordelen van de ontwikkeling van het huidmodel, maar verdere experimenten zijn nodig om dit te bevestigen. Zoals eerder vermeld, heeft deze methode kan meerdere monsters parallel lopen. Het is ook mogelijk om monsters te nemen tijdens de teelt te meten permeabiliteit, waardoor het observeren van de ontwikkeling van deze parameter van het huidmodel.

Opgemerkt moet worden dat permeabiliteit gelijktijdig wordt gemeten door middel van een gel/collageen-cel-model en een membraan. De gedetecteerde permeabiliteit coëfficiënt is systeemspecifieke, waarbij de resultaten van verschillende huid modellen alleen kunnen worden vergeleken bij het gebruik van de dezelfde membraan invoegen. Bovendien moet de huidmodel ter dekking van de gehele teeltoppervlak om ervoor te zorgen dat de teststof alleen via het objectmodel doordringen zal en niet ernaast, die fouten in de permeabiliteit gemeten veroorzaken zou. Een ander aspect dat moet worden beschouwd in de toekomst experimenten is de natuurlijke omgeving van de huid. Normaal gesproken is de temperatuur van het huidoppervlak lager in vergelijking met de binnenste regio, die invloed op permeatie voorwaarden uitoefenen kan.

Om het uitlijnen van lab experimenten met computersimulaties, werd een methode waarmee de parameter optimalisatie voor toegepaste simulatie gepresenteerd. Simulaties bleken te laten samenvallen met experimentele gegevens voor stoffen met kleine moleculaire maten. Echter, afwijkingen tussen simulatie en experimentele gegevens werden vastgesteld voor stoffen met grotere moleculaire maten. Grote polysaccharide moleculen kunnen verhogen van wrijving en vertragen het proces van verspreiding in een gel. Dit effect veroorzaakt een abnormale verspreiding, oftewel een mogelijke reden voor de afwijking tussen de experimenteel en simulatie waarden33,34. Een andere verklaring zou zijn de aanwezigheid van kleinere of grotere deeltjes in fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran. De fabrikant geeft het molecuulgewicht van de stof als de gemiddelde grootte met een bepaald bereik, waardoor kleinere en grotere deeltjes aanwezig te zijn. Het is ook onduidelijk hoe verspreid deze stoffen zijn, zoals de kleinere deeltjes sneller via de gel en de vloeistof kanaal doordringen. Het is mogelijk om uit te breiden van de simulatie te overwegen deze verspreiding en de effecten van wrijving.

De permeabiliteit experiment en simulatie werden ontwikkeld voor gebruik in een 2-OC. Met de hulp van de simulatie, kan deze experimentele methode rechtstreeks worden overgedragen aan meer geavanceerde experimentele opstellingen. Bijvoorbeeld, kan de membraan invoegen systeem simulatie gemakkelijk worden overgedragen aan de geometrie van een 2-OC of andere systemen met soortgelijke constructies. Deze optie voor het moduleren van de simulatie kan worden gebruikt ter ondersteuning van het ontwerp van toekomstige experimenten. Daarnaast kunnen bijwerkingen zoals verdamping, abnormale verspreiding en membraan effecten worden geïntegreerd ter verbetering van de simulatie, waardoor de nauwkeurigheid. De simulatie programma biedt de mogelijkheid om te wijzigen of verbeteren van de simulatie-vergelijking, evenals over het integreren van andere fysieke modules om te onderzoeken van andere aspecten van de huid model ontwikkeling. Een voorbeeld is de simulatie van de glucose consumptie en lactaat productie in een collageen cel model.

Een bijzonder interessant aspect in het testen van medische stoffen is hoe de stoffen worden gedistribueerd in een systeem van orgel-on-a-chip. De simulatie en permeabiliteit parameter mijn hulp te beantwoorden vragen zoals hoe snel een stof doordringt in het systeem en welke concentratie beschikbaar voor andere weefsels in een multi-organ-chip zijn zal. Deze methode kan ondersteunen en versterken van de ontwikkeling en het testen van dergelijke orgel-on-chip-systemen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk is gemaakt met financiële steun van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onder subsidie Nee. PO413/12-1 en LA 1028/7-1.

Materials

Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen  Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS  Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -. F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -. M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing – organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It “Normal”?. J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk’s guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Tags

Membrane Insert SystemPermeabilityDiffusionOrgan-on-a-chipAgarose GelCollagen Cell ModelKeratinocytesDonor SubstanceAcceptor SubstanceFluorescence Measurement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hsu, H., Kracht, J., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image