JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Bir yöntem belirleme geçirgenliği ve Difüzyon bir zarda bir 3D doku modelindeki simülasyonu için ekleme sistemi çok iyi kaplamalar için

Published: February 23, 2018
doi:
10.3791/56412
, , , , , , ,
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering,Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology,Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

Summary

Bir membran geçirgenliği belirlenmesi için bir yöntem eklemek çok iyi plakaları için sistem ve silico parametre optimizasyonu simülasyon kullanarak Difüzyon katsayıları hesaplanması için sunulmaktadır.

Abstract

Vitro ekili cilt modelleri eczacılık ve kozmetik uygulamaları için giderek ilgili olmuştur ve aynı zamanda ilaç geliştirme yanı sıra madde test kullanılır. Bu modeller çoğunlukla membran ekleme sistemleri, onların geçirgenliği farklı maddelerin önemli bir faktör olan doğru ekili. Genellikle, bu parametrelerin belirlenmesi için uygulanan yöntemler genellikle büyük örneklerin boyutu (örneğin, Franz Difüzyon hücre) veya zahmetli donanımları (örneğin, photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra Floresans kurtarma) gerektirir. Bu çalışmada geçirgenlik katsayıları doğrudan membran-INSERT sistemlerinde 4,26 mm ve 12.2 mm (yetiştirme alanı) çapı boyutları ile belirlemek için bir yöntem sunar. Yöntem özel ve kollajen jelleri gibi cilt modelleri temsil eden bir kollajen hücre modeli ile doğrulandı. Farklı moleküler boyutta ve Permeasyon (kollajen jel, fibroblast ve HaCaT oluşan) farklı hücre modelleri aracılığıyla maddelerin nüfuz işlemler doğru bir şekilde açıklanmıştır.

Ayrıca, yukarıda deneysel yöntem desteklemek için bir simülasyon kurulmuştur. Simülasyon küçük moleküler boyutta maddeler için iyi deneysel veriler kadar 14 x 10-10 m Stokes RADIUS ile uyar (4.000 MW), ve bu nedenle sistem açıklamak için bir gelecek vaat eden bir araçtır. Ayrıca, simülasyon deneysel çalışmaları önemli ölçüde azaltabilir ve genişletilemez veya daha karmaşık kurulumları için uyarlanmış için sağlamdır.

Introduction

Organo-tipik 3D kültürler için güçlü araçlar ilaç geliştirme ve1test madde haline gelmiştir. Bu bağlamda, insan derisi modellerdir bu kozmetik sektöründe gibi düzenleyici şartları nedeniyle özel ilgi. Onlar daha sonra kullanılmak üzere ya olarak kendi tek organ kültürleri çok iyi plakaları veya multi-organ-cips ek organ modelleri, örneğin, karaciğer2ile birlikte çok sayıda 3B cilt modelleri geliştirilmesi açmıştır.

Cilt eşdeğer tarımı ile ilgili olarak, hava-sıvı arayüzey (ALI) uygun epidermal farklılaşma3için gerekli bir öğedir. Hücre kültür ekler altındaki sıvı geçirgen bir zar ile bir gemi oluşan genellikle bir ALI kurmak için kullanılır. Alış 12-iyi (12.2 mm çapında) tabak kadar piyasada bulunan deri modelleri EpiDerm4, Phenion5ve Episkin6, Cilt modelleri 96-iyi (çapı 4,26 mm) arası bedenleri ile kültür gibi yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada açıklanan yöntemi maddelerin nüfuz bir membran Ekle sisteminde belirler.

Permeabilite katsayısı doğal cilt5‘ e göre kültürlü herhangi bir cilt model kalitesini değerlendirmek için önemli bir parametredir ve nasıl hızlı bir şekilde değerlendirmek için kullanılan aktif maddeler deri yoluyla geçiş. Bu parametre özellikle cilde uygulanan ilaçlar ya da kozmetik ürünler ihtiyacınız varsa, tam olarak etkin aracılar üzerinden geçirdiğinizde anlamak önemlidir. Bir simülasyon daha fazla sistem davranışını tahmin etmek ve daha sonra gerekli zaman alıcı deneysel çaba azaltmak için yardımcı olabilir, özellikle büyük bir set ne zaman maddeler yer almaktadır.

Franz Difüzyon hücre Permeasyon cilt ile deneyler ve cilt5,6,7,8,9modelleri state-of–art belirtilir. Bu aygıt sabit örnek (Difüzyon bariyer) ile iki bölmeleri arasında oluşur. Test edilecek madde örnek (donör bölme) tepesine doğrudan uygulanır ve ilk bileşik toplama ters (alıcısı) yuvası üzerinde tespit edilebilir. Alıcısı tarafında sabit sıcaklık ve homojen madde konsantrasyonu sıcaklık odası ve bir manyetik karıştırıcı sağlanır. Örnekler bir örnekleme kol Franz hücre alıcısı tarafında alınabilir. 19 cm ve 179 cm arasında bir yükseklik aralığı ile bu nispeten büyük10,11sistemidir. Difüzyon katsayıları jel benzeri maddeler ve dokuların tespiti için başka bir yöntem sıkı BAĞLAMAK ‘s. Bu teknik ağartma prensibi fluorescently jel ve ağartılmış çevrenin kurtarma süresini belirleme parçacıklar etiketli Difüzyon katsayısı12,13,14hesaplamak için kullanır.

Ayrıca, Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi ile kızılötesi ışık Absorbans parçacık hareketi algılamak için cilt15,16maddelerin nüfuz işlemi belirlemek için kullanılabilir. Her nasıl, bunlar veya diğer görüntüleme yöntemleri (örneğin, İki fotonlu Floresans korelasyon spektroskopi17) yoğun aletleri fiyat.

Bu makalede, bir yöntem bir membran ekleme sistemi içinde bir bariyer geçirgenliği nerede deri manken ekili olabilir doğrudan ölçmek için sunulur. Bu yöntem, çok sayıda küçük örnekleri (4,26 mm de boyutu kadar) ile kompakt bir sistemde çalışmasına permeabilite deneyleri sağlar. Burada ayrı bir aygıt üstünde belgili tanımlık aygıt takılacak olan her sonda için gereklidir ve küçük örnekleri (4,26 mm boyut) için fark etmek zordur Franz Difüzyon hücre aksine bu. Yöntem büyük araçları (örneğin, confocal veya multiphoton mikroskop) gerektirmez, Ayrıca, zaman ve maliyet bir azalma elde edilir.

Tüm deneyler gözenekli membran içinde gerçekleştirilen özel jel veya membran üzerinde kurulan bir kollajen hücre modeli içeren sistemleri ile bir örnek (bariyer) yerleştirin. Moleküler boyutları değişen floresan maddeler (donör) örnek tepesine uygulandı ve nüfuz madde konsantrasyonu Floresans plaka okuyucu kullanarak altta (alıcısı) tespit edildi (bkz. şekil 1). Yöntem doğrulamak ve bu simülasyon doğruluğunu sınamak için özel jelleri üretilen ve bir engel olarak kullanılır. Hydrogels Genel Biyoloji Bilimleri13gözenekli ortamda Difüzyon ve Permeasyon işlemlerinde incelenmesi için kullanılır. Yöntem sonra bir basitleştirilmiş cilt modeli18,19 olan kollajen matrisi birincil fibroblastlar ve insan yetişkin düşük kalsiyum yüksek sıcaklık keratinositler (HaCaT) hücreleri (hücre-matris model), oluşan hücre numaralı seribaşı bir sistem test edildi .

Ayrıca, nüfuz işlemi aracılığıyla akış simülasyonlar Hesaplamalı akışkanlar dinamiği ile simüle. Bu parametre optimizasyon yoluyla, deneysel verilerden Difüzyon katsayısı hesaplanması, bulundu. Genel olarak, bu simülasyon farklı uygulamalar sunar; Örneğin, üzerinde kısa deney temelinde bir nüfuz işlem tahmin etmek mümkündür ve simülasyon deneyler sayısını önemli ölçüde azaltabilirsiniz.

Deneysel yöntem ve simülasyon bir organ-on-a-chip sistem1,20,21uygulama için tasarlanmış, özellikle 2-organ-çip (2-OC) ticari olarak1,22geliştirilen, 23,24,25. Prensip olarak, membran Ekle sistemlere dayalı herhangi bir organ modeli Permeasyon süreci bu şekilde tanımlanabilir.

Protocol

1. geçirgenliği çalışmaları için örnek hazırlanması Not: özel jel veya cilt modeli ekimi üzerinde alan bir hücre matris model içeren bir örnek Permeasyon ölçümleri ve simülasyonlar doğrulamak için kullanıldı. Özel jel 0.2 g özel yüksek çözünürlüklü tozu H2O 10 ml (çift distile su) geçiyoruz. Çözüm mix ve ilâ 80 ° c ısı 8 dk. için sıcaklık sürdürmek. 96-şey zar ekle sistem (çapı 4,26 mm) membran 28,6 µL özel jel uygulayın veya kullanım 226 µL 12 şey zar için ekleme sistemi (12 mm çapında) (örneğin, Transwell sistem). Jel katılaşmış kadar 10 dk bekle. Kollajen jelNot: Tüm adımlar steril koşullarda gerçekleştirilir ve çözümleri kollajen jel polimerizasyon yavaş buzda tutulur. Mix 125 µL, Hanks dengeli tuz çözüm (HBSS) ile 1 mL % 0,4 kollajen R çözeltisi (sıçan kuyruk kolajen). Çözüm 1 M NaOH (sodyum hidroksit) (~ 6 µL) ile fenol red değişikliklerden sarı kırmızı rengini kadar titre. Dulbecco’nın modifiye kartal orta (DMEM) + % 10 fetal buzağı serum (FCS) 125 µL kollajen jel ve dikkatli bir pipet ucu ile karıştırın. Kollajen jel 28,6 µL 96-şey zar ekle sistem veya 12-şey zar ekleme sistemi için 226 µL membran uygulanır. Bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) jel 30 dk için bırakın. Kollajen hücre modeli ile fibroblastNot: Tüm adımları steril koşullar altında yürütülür. Birincil fibroblastlar 5-7 gün deneme önce hazırlayın. DMEM + hücre kültür şişeler (75 cm2) % 10 FCS ile fibroblastlar yetiştirmek ve orta 2-3 günde değiştirin.Not: hücreleri daha çok sayıda deneysel kurulumuna bağlı olarak, kullanılabilir. Orta hücre kültür şişeye (% 80 birleşmesi) kaldırın ve yıkama iki kez 10 mL (kültür şişesi 75 cm2) fosfat serum (PBS) arabelleğe alınmış. % 0.05 3 mL ekleyin tripsin / ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ve 37 ° C’de 3 min için kuluçkaya Hücre yüzeyinden ayırmak için kültür şişesi üzerinde hafifçe dokunun. Reaksiyon DMEM + % 10 FCS 3 mL ekleyerek durdurmak. Çözüm bir santrifüj tüpüne aktarın. 120 x g de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve DMEM + % 10 FCS 0.5 mL hücrelerle resuspend. Hücreleri saymak ve 0.5 106 hücre/mL x konsantrasyon için ayarlayın.Not: Aşağıdaki adımları kollajen jel polimerizasyon yavaş buzda yürütülür. Mix 125 µL 1 mL % 0,4 kollajen R çözeltisi ile HBSS in. Çözüm 1 M NaOH ile titre (~ 6 µL) fenol kırmızı rengi sarıdan kırmızıya dönüşünceye kadar. Hücre süspansiyon, 125 µL ekleyin (DMEM + % 10 FCS + 0.5 x 106 hücre/mL) kolajen içine jel ve dikkatli bir pipet ile karıştırın. Kollajen jel 28,6 µL 96-şey zar ekleme sistemi membran üzerinde uygulama veya sistem Ekle 226 µL 12-şey zar için. Bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) jel 30 dk için bırakın. DMEM + % 10 FCS 75 µL jel yüzeyinde uygulamak ve 96-şey zar alıcı tabak için 300 µL sistem ekleyin. 12-şey zar için sistem eklemek, 590 µL hacmi alıcı plaka yüzey ve 1,846 µL için kullanın. Orta hücre matrix modeli (Hava Asansör) yüzeyinden çıkarmak ve daha fazla hücre matris model için 7 gün kuluçkaya. 100 μl orta alt ve orta her gün. Kollajen hücre modeli HaCaT ileNot: Tüm adımları steril koşullar altında yürütülür. HaCaT hazırlamak 5-7 gün önce aşağıdaki adımları. HaCaT DMEM + % 5 FCS içinde bir hücre kültür şişesi (75 mm2) ile yetiştirmek ve orta 2-3 günde değiştirin.Not: hücreleri daha çok sayıda deneysel kurulumuna bağlı olarak, kullanılabilir. Orta balonun kaldır ve iki kez 10 mL ile (kültür şişesi 75 cm2) PBS yıkayın. % 0.05 3 mL ekleyin tripsin/EDTA ve 37 ° C’de 10 dakika için kuluçkaya 3 mL ile reaksiyon DMEM + % 10 FCS durdurmak. Çözüm bir santrifüj tüpüne aktarın. 120 x g de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve DMEM + % 10 FCS 0.5 mL hücrelerle resuspend. Hücreleri saymak ve 0.5 106 hücre/mL x konsantrasyon için ayarlayın.Not: Aşağıdaki adımları kollajen jel polimerizasyon yavaş buzda yürütülür. Mix 125 µL 1 mL % 0,4 kollajen R çözeltisi ile HBSS in. Çözüm 1 M NaOH ile titre (~ 6 µL) fenol kırmızı rengi sarıdan kırmızıya dönüşünceye kadar. DMEM + % 10 FCS 125 µL kollajen jel ve dikkatli bir pipet ile karıştırın. Hücre süspansiyon 28,6 µL 96-şey zar ekleme sistemi membran üzerinde uygulama veya sistem Ekle 226 µL 12-şey zar için. Bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) jel 30 dk için bırakın. 75 µL hücre Süspansiyon Jel yüzeye uygular ve DMEM + % 10 FCS 96-şey zar alıcı tabak için 300 µL ekleme sistemi ekler. 12-şey zar için sistem eklemek, 590 µL hücre süspansiyon hacmi DMEM + % 10 FCS alıcı plaka için yüzey ve 1,846 µL için kullanın. Hücre matrix modeli için 3 gün kuluçkaya; Orta 2 gün sonra değişimi. Orta hücre matris model yüzeyindeki çıkarmak ve hücre matrix modeli için daha fazla 7 gün kuluçkaya. 100 µl orta alt ve orta her gün. Kollajen hücre modeli ile fibroblastlar ve HaCaTNot: Tüm adımları kollajen jel polimerizasyon yavaş buzda steril koşullar altında yürütülür. Fibroblastlar adım kadar 1.3.5 1.3 adımda anlatıldığı gibi ve bir gün sonra HaCaT açıklandığı gibi adım 1.4 kadar 1.4.4 hazırlayın. HBSS, Mix 125 µL % 0,4 kollajen R çözüm 1 ml. 1 M NaOH ile çözüm nötralize (~ 6 µL) fenol kırmızı rengi sarıdan kırmızı bir menekşe dönüşünceye kadar. DMEM oluşan birincil fibroblast hücre süspansiyon, 125 µL Ekle + % 10 FCS + 0.5 x 106 hücre/mL kollajen jel ve dikkatlice karıştırın. 96-şey zar ekle sistem veya 12-şey zar ekleme sistemi için 226 µL membran hücre süspansiyon 28,6 µL uygulamak. Bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) jel 30 dk için bırakın. Daha sonra DMEM + % 10 FCS 75 µL jel yüzeyi ve 300 µL üstünde-e doğru alıcı plaka 96-şey zar Ekle sisteminin uygulayın. 12-şey zar için sistem eklemek, 590 µL hacmi alıcı plaka yüzey ve 1,846 µL için kullanılır. 37 ° C ve % 5 CO21 gün kuluçkaya. Orta yüzeyden kaldırın ve 106 hücre/mL x 0,5 ile HaCaT hücre süspansiyon ekleyin. 1.5.6. adım daha önce açıklandığı gibi aynı birimdir. Hücre matrix modeli için 3 gün kuluçkaya; Orta 2 gün sonra değişimi. Orta hücre matris model yüzeyindeki çıkarmak ve hücre matrix modeli için daha fazla 7 gün kuluçkaya. 100 µl orta alt ve orta her gün.Not: Bu soruşturma için 3 jel/hücre-model örnekleri 12-şey zar ekle sistem için hazırlanmıştır. 96-şey zar için sistem eklemek, biz 6 örnekleri jel/hücre modeli için kullanılan. İstatistiksel demek için 3 örnekleri yaygındır. Ama kollajen matris model 96-şey zar Ekle sistemiyle deneylerde hataları ve hücre kültürü için sapmaların beklenen. Bu nedenle, çok sayıda örnekleri seçtik. 2. geçirgenliği çalışmaları zarda sistemi yerleştirin Donör maddeNot: İki fluoresein sodyum tuzları (binek) üretilmektedir. H2O 0.1 mg/mL ve 0.01 mg/mL konsantrasyon, binek geçiyoruz. Farklı floresein isothiocyanate-dextranes (FD) 4.000, 10.000, 20.000 ve 40.000 g/mol Moleküler ağırlığı ile H2O 2 mg/mL bir konsantrasyon, içinde çözülür. Bu çözümleri ile özel jel geçirgenlik deneyler (bkz. şekil 1) verici madde olarak kullanır. Kollajen hücre modeli ile kurulum için DMEM + % 10 FCS yerine su ile tüm çözümleri hazırlayın.Not: stok Çözümleri (10 yüksek konsantrasyon x) donör madde hazırlamak. Küçük bağış toplama varyasyon geçirgenliği deney sonuçlarını etkileyebilir. Deneysel yöntemNot: 37 ° C ve nem oranı % > 90 geçirgenliği deney yürütülür. Bu parametre hücrelerin canlılık sağlar. Özel jel, kollajen jel ve kollajen hücre modeli ile deneyler için kullanılan aynı parametreleri bu yüzden sıcaklık Difüzyon işlemi etkiler. Güç bilgi içinde belgili tanımlık destek 12-şey zar ekleme sistemi anlamına gelir. 96 – (veya 12-) şey zar hazırlamak özel oluşan bir bariyer sistemiyle Ekle (bkz: Protokolü 1.1) jel veya hücre modeli (bkz: Protokolü 1.2-1.5) ve floresan verici madde. Hazırlamak dilutions 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 ve 1:320 standart bir eğri oluşturmak için donör madde. 300 µL (1,846 µL) üç kuyular her seyreltme alıcı plaka pipet. 12-şey zar için sistem kullanımı bir ayrı alıcı tabak yerleştirin. Seri dilutions ölçülen Floresans [RFU] [mg/mL] eşdeğer konsantrasyon dönüştürmek için kullanılır. Örnek (özel jel veya hücre modeli) üzerine donör madde 75 µL (590 µL) ve 300 µL (1,846 µL) alıcısı madde ekleyin (H2O ya da DMEM + % 10 FCS) alıcı plaka (bkz. şekil 1).Not: sıvı zarda yüzeylerin sistemi yerleştirin ve alıcı plaka hidrostatik basınç önlemek için aynı düzeyine sahip olun. Bir shaker kuluçka tüm sisteme aktarın. Homojen karıştırma ulaşmak için sallayarak ayarlamak (Toplam Strok yörünge 1.5 mm, hız için bir rotasyon ile ilgili düzeyinde 3.5, ayarlanabilir ~ 480 1/min) Difüzyon işlemi etkiler bir konsantrasyon gradyanı önlemek için. Floresans düzenli olarak her saat belirlemek. Floresans ölçmek, membran ekle sistem boş bir levha aktarmak ve floresan bir plaka okuyucu kullanarak alıcı içinde ölçmek için. Bir uyarma dalga boyu 485 nm ve 535 emisyon kullanın nm floresein için. Deneme 5 h için çalıştırın.Not: deneyler sırasında tüm sistemden sıvı buharlaşır. Buharlaşma donör ve alıcısı konsantrasyon değiştirir ve sonuçları etkiler. Bu etki söz konusu olduğunda çalışan bir zamanı 5 h, ama daha uzun çalışan kez düşünülmesi gereken ihmal edilmesi. Permeabilite katsayısı hesaplama Standart eğri kurmak için seri dilutions konsantrasyon karşı floresan arsa ve verilerin üzerine bir doğrusal regresyon gerçekleştirmek. Doğrusal regresyon eğimi konsantrasyon nüfuz deneme Floresans verileri dönüştürmek için kullanın. Simülasyon amacıyla mol/m3içine birimleri dönüştürün. Bir fonksiyonu olarak konsantrasyon zaman içinde çizmek ve (bkz: Şekil 2) veri doğrusal parçası kurmak. Bu doğrusal bölümü eğimini belirlemek ve permeabilite katsayısı aşağıdaki denklemi göre hesaplamak ( Şekil 2′ deki örneğe bakın):nerede dcA/ dt alıcısı tarafı içinde madde konsantrasyonu zaman içinde değişim (yamaç); CD konsantrasyon donör tarafında olduğunu; P permeabilite katsayısı olduğunu; A Permeasyon yüzey ve VA alıcısı hacmi olduğunu. Bu denklem Fick’ın ilk hukuk fakültesinden elde edilir ve yalnızca otelde uygulanabilir CD » CA6,22. Not: Donör konsantrasyonlarda çok alıcısı algılanan konsantrasyonu daha yüksek olmak zorunda. Bu deneysel kurulumunda doğrulandı. 3. simülasyon Not: Simülasyon COMSOL Multiphysics 5.1 ile yapıldı. Bu temel bir bilgi kabul edilir. Difüzyon simülasyon için aşağıdaki varsayımlar yapılmıştır: (a) H2O maddelerin Difüzyon katsayısı jel ile karşılaştırıldığında çok yüksek. Bu fark için benzetim 1 x 10-9 m2/s bir faktörü 10 100 binek Difüzyon katsayısı % 2 özel jel ile karşılaştırıldığında daha yüksek olan değerini kullanır. (b) denemede, madde bariyeri dağılır ve membran membran sistem ekleyin. Deneysel kurulum aksine, sanal özel jel ya da hücre matris ve membran bir homojen faz sayılır. (c) sınır etkileri duvarlarında “slip yok”, duvarlar üzerinde tüm kayan etkisi için ayarlanır (sıvı ve jel veya sıvı ve hücre arasında değil modeli) membran ekleme sistemi ihmal edilir ve Difüzyon işlemi için önemli değildir. Kurulum Difüzyon simülasyonNot: Aşağıdaki adımları kur geçirgenliği deney simülasyon göstermektedir. Simülasyonlar 96 – ve 12-şey zar ekleme sistemleri için ayrı ayrı belirlenmiştir. “Kimyasal türler taşıma” modülü Difüzyon Fick’ın ikinci yasası üzerinde dayalı bir denklem kullanır:nerede c madde konsantrasyonu olduğunu, t zamanı, u hızı olduğunu, D Difüzyon katsayısı ise R reaksiyon oranı. Hiçbir kimyasal reaksiyon Difüzyon süreçte oluştuğu için reaksiyon oranı ihmal. Programı açın ve yeni bir modeli başlar. Seçti “Modeli Sihirbazı”, seçin 3D modeli, “Taşıma seyreltilmiş türlerin” fizik arabirimi ile açılan menü “Üzerine çalışma”‘ı tıklatın, “Zaman bağımlı” çalışma seçin ve tıkırtı “Bitmiş” ekleyin. “Küresel tanımları” gidin ve sağ tıklama ile “Parametreleri” ekleyin. Kılavuzda geometrik ve fiziksel parametrelerini girin ( Tablo 1, Tablo 2ve şekil 3ebakın).Not: Özel jel bir 96-şey zar Ekle sisteminde içbükey yüzeyi ile bir daldırma topu yaklaşık olarak. Membran ekleme sistemi geometri kadar deneylerden ayarlayın. Adım 3.2, 96-şey zar ekleme sistemi geometri oluşturmak nasıl bir örnek gösterilir. Uzunluk birimi ayarlanır metre.Not: tüm Geometri Hesaplama zaman kazanmak için kurmayın. Bunun yerine, geometri Merkezi çizgilerini üç aylık geometri kullanarak azaltılabilir (bkz: şekil 3a ve şekil 3b). İki “etki alanı probları” “(sağ tıklayın”Tanımları”ve”Sonda”bulun) tanımlarında” ekleyin ve bir sonda alıcısı etki alanı ve diğer donör etki alanı olarak seçin. Her ikisi de “Ortalama” ve “c” adet “mol/m3” ile ifade türü için seçin.Not: Bu adım isteğe bağlıdır ve alıcısı ve donör konsantrasyon simülasyon sırasında gösterir. “Ulaşım özelliklerinde 1” “seyreltilmiş tür”olarak “Dif_w”. taşımacılığının Difüzyon katsayısı (Dc) ayarlaNot: “Aktarma özellikleri 1” alıcısı ve donör etki alanı olarak kullanılır. Sonraki adımda,-ecek var olmak overwritten bariyer etki alanı. “Seyreltilmiş türlerin taşıma” ikinci bir “Aktarma özellikleri 2” ile sağ tıklayın eklemek ve “Etki alanı seçimi” bariyer (2) seçin. Simülasyon amacı bağlı olarak Difüzyon katsayısı bariyer değeri veya bir kukla değişken “D” olarak ayarlayabilirsiniz. İlk test çalıştırması için 2E-10 m2/s değerini ayarlayın.Not: “D” Adım 3.3 daha sonra ilan edilecek. “Taşıma, seyreltilmiş türlerin” için “ilk değerleri 1” sıfır olarak konsantrasyonu tanımlayın.Not: “Başlangıç değerleri 1” bariyer ve alıcısı etki alanı olarak kullanılır. Sonraki adımda, donör etki alanı yazılacak. “Seyreltilmiş türlerin taşıma” ikinci “İlk değerleri 2” hakkı olan tıkladığınızda ekleyin ve donör (3) etki alanı olarak seçin. Konsantrasyonu donör madde (örneğin, C_fl tablo 2) başlangıç konsantrasyonu olarak ayarlayın. Doğru tıkırtı üstünde “Seyreltilmiş türlerin taşıma” ile “Simetri 1” eklemek, ekleyin ve tüm geometri ayna “Sınır seçimi,” Tüm yüzeylerin seçin (Adım 3.2 geometrisi örneğin sınırıdır numara 1, 2, 4, 5, 7, 8).Not: Tüm geometri ayarlanırsa bu noktada ihmal. Doğru tıkırtı üstünde “Mesh” iki “ücretsiz Dörtyüzlü” ekleyin. Bariyer (2) (“Etki alanı” içine geometrik varlık düzeyini değiştirme) etki alanı olarak seçin. “Boyut” sağ tıklama ile eklemek-üstünde “ücretsiz Tetrahedral 1” ve için önceden tanımlanmış kafes sistemi “İnce” için 12-şey zar eklemek veya “çok iyi” bir 96-şey zar için eklemek sistem. İçinde ikinci “ücretsiz Dörtyüzlü” seçin alıcısı ve donör olarak etki alanı ve bir 12-şey zar için önceden tanımlanmış kafes “Normal” eklemek sistem veya “İnce” bir 96-şey zar için eklemek sistemi (bkz: şekil 3 c ve 3d şekil).Not: Hesaplama zaman kazanmak için kaba bir kafes seçmek mümkündür. Bu sonuçlarının doğruluğunu azaltabilir. Tıkırtı üstünde “Build All” in “Mesh mesh geometrisi için ayarlama”. Simülasyon “hesaplama” ile başlar “Çalışma 1”. Bir geometri örnek kurulumuNot: Burada 96-şey zar Ekle sistemiyle (içbükey bariyer) geometrisini kurmak nasıl bir örnek verilir. Tüm adımları program geometri modülü yürütülür. Uzunluk birimi ayarlanır metre. D_w/2 ve yüksekliği h_sp + h_b + h_a RADIUS bir silindir 1 (doğru tıkırtı üstünde “Geometri 1”) oluşturur. D_tran/2, h_sp h_b + h_a ve z konumunu yüksekliğini RADIUS ile 2 silindir oluşturun. “Fark” seçeneğini kullanın (doğru tıkırtı üstünde “geometri 1” bulun “Boolean değerleri ve bölüm”) Silindir 2 silindir 1 dan çıkarmak için. Seçti “cyl1″ Nesneleri’ndeki”eklemek”, “nesnesini çıkartmak için” etkinleştirmek ve “cyl2” seçti. Yeni birimin alıcısı geometrisini olduğunu. Bir silindir 3 RADIUS d_a/2, h_b yüksekliğini ve h_sp z konumunu oluşturmak. Yarıçapı r ve z pozisyon r_z ile bir küre 1 oluşturmak. Küre 1 (sph1) silindir 3 (cyl3) dan çıkarmak için “Fark” seçeneğini kullanın. Yeni birim fark 2 denir. Bir silindir 4 RADIUS d_a/2, h_b + h_a yüksekliği ile oluşturmak ve h_sp z konumlandırın. Silindir 4 (cyl4) fark 2 çıkarmak için “Fark” seçeneğini kullanın. Yeni birimin alıcısı geometrisini olduğunu. Adımları 3.2.4-3.2.6 bariyer (özel jel veya hücre modeli deneyinde) oluşturmak için yineleyin. (Doğru tıkırtı üstünde “Geometri 1” bulun “Boolean değerleri ve bölüm”) tüm geometri elemanlarının Birliği 1 yapmak. Bir blok 1 d_tran uzunluğa ayarlayın tüm kenarları oluşturmak * 2, pozisyon x – d_tran ve d_tran y * 2. 2 d_tran tüm kenar uzunluğu ile bir blok oluşturmak * 2, pozisyon x – d_tran * 2 ve y – d_tran. Çıkarma Birliği 1 blok 1 ve 2 blok “Fark” seçeneğini kullanın. Parametre optimizasyonu için simülasyon eklemeNot: önceden oluşturulan deneysel verilere Difüzyon katsayısı parametresi optimizasyonu yardımı ile takılabilir. Aşağıdaki yönergeler, Optimizasyon Bölüm Difüzyon simülasyon entegre gösterilmiştir. Difüzyon simülasyon adımları başlatmadan önce çalıştığından emin olun. Fizik-modülü “” Fizik Ekle”kullanarak en iyi duruma getirme” ekleme (en iyi duruma getirme “Matematik” kategorisinde “En iyi duruma getirme ve duyarlılığı” bulunabilir) simülasyonu için. “Bileşenine Ekle” seçeneğini tıklatın. “Değişken” altında “Tanımları” (Yerel bileşeni) sağ tıklatın ve Tablo3 değişkenleri yazın ekleyin.Not: Parametre optimizasyonu Reel sayılar, Yanikullanır, difüzyon katsayısı faktör 1-10 ayrı olarak tanımlanması gerekir. Operatör adı “Alıcısı” Bölüm “Bileşeni kaplin” ve tip “tanımları” sağ tıklayın “Ortalama 1” ekleyin. Deneysel verilerin bir ayrı metin belgesi oluşturun.Not: Sütun noktalı ayırır; satır sonu satırları ayırır. Saat bildirimi, konsantrasyon mol/m3saniye cinsinden ölçülür. İlk kaldırın ve ikinci veri noktası gecikme aşamasında (bkz. Şekil 2) mümkün montaj hataları önlemek için deneyler. İşte bir örnek nasıl metin belgesi aşağıdaki gibi görünmelidir:3540;      0.002167140;      0.0072412240;    0.0170715180;    0.0223018660;    0.0269721540;    0.02931Bu örnek simülasyon test etmek için kullanılabilir. “En küçük kareler programın amacı” ile doğru tıkırtı “Optimizasyonu” Ekle, metin belgesi 3.3.4 adımından “deneysel veriler” eklemek ve ilk sütun olarak tanımlamak “saat sütunu 1” ile sağ tıklayın “En küçük kareler programın amacı” ve ikinci sütun olarak “İle sütun 1 değeri” doğru “En küçük kareler programın amacı üzerinde” tıkırtı. “Değer sütun” içinde “deyim” değişken “C” yazın. “Genel kontrol değişkenleri 1” ile “Optimizasyon” sağ tıklayın ve değişken olarak bir başlangıç değeri “1”, alt sınır “0” ve üst sınır “1000” ile “D_search” ilan ekleyin. Ekle “En iyi duruma getirme” ile doğru tıkırtı “Çalışma 1” ve “SNOPT” bir en iyi duruma getirme çözücü yöntemi olarak seçti. 1E-9 için optimum toleransını ayarlayın.Not: simülasyon yakınsama değil, optimum Dayanıklılık artırın. Simülasyon optimum toleransı çok büyükse yanlış olacaktır unutmayın. Parametre optimizasyonu “hesaplama” ile “çalışmada” başlatın. Difüzyon katsayısı engel “D” olarak ayarlamak unutmayın.

Representative Results

Bir simülasyon doğruluğunu değerlendirmek için bir engel yürütülen gibi bir 96-şey zar geçirgenliği deneyler % 2 özel jel sistemiyle yerleştirin. Fluoresein sodyum tuzu (binek) ve floresein isothiocyanate-dextranes (FD) 45 x 10-10 m Stokes RADIUS (376.27-40,000 mol wt) ile 5 x 10-10 m akışkanın maddenin moleküler boyutu etkisini doğrulamak için kullanılmıştır. Simülasyon’ın yerel parametre optimizasyonu simülasyon deneysel verilere uyacak şekilde kullanıldı. Bu amaçla, sadece doğrusal parçaları simüle geçirgenliği yamaçları deneysel sonuçlar karşılaştırıldı. Küçük moleküler boyutları için simülasyon ve deneysel veriler (bkz. şekil 4a ve 4b rakam) iyi sözleşmede ,2 için binek ve .2 FD 4.000 için… Daha büyük moleküler boyutu yüksek sapmalar korelasyon ,5 FD 10.000, .7 FD 20.000 için ve .6 FD 40.000 için gösterilen oluşturulan. Simülasyonlar ilerlemesinde eğri bir gecikme başlangıç ve grafikler (bkz. şekil 4 c-4e) daha fazla seyri daha güçlü bir artış gösterdi. Geçirgenlik katsayıları ve simüle Difüzyon katsayıları are göstermek içinde Tablo 4. Permeasyon katsayısı ile artan moleküler boyutu azalır. Standart sapma olduğunu 0,47 x 10-8 m/s arasındaki 0.08 x 10-8 m/s (N = 7), hangi denk %4,18 % 46.15 arası mutlak bir hata için. Büyük moleküllerin ile deneyler büyük mutlak hata gösterdi. Simüle Difüzyon katsayıları çok benzer şekilde deneysel geçirgenlik katsayıları için davrandım. Daha büyük Stokes yarıçapı maddelerle gösterdi azalan Difüzyon katsayıları ve mutlak hata %9,09 ve .46 arasında değişmektedir (N = 3). Engelleri bir 12-şey zar içinde sistem eklerken ek Permeasyon deneylerde, dört farklı kollajen hücre modeli türleri kullanılmıştır. Bu modeller bir boş hücre modeli ve kollajen jel ve HaCaT birincil fibroblastlar yüzeyi farklı kombinasyonları ile bir hücre modeli oluştururlar. Aşağıdaki kombinasyonları kullanılmıştır: kollajen (Albay) olarak bir boş hücre modeli, kollajen + fibroblastlar (Albay + F.), kollajen HaCaT (Albay + H.) ve kollajen fibroblastlar +++ HaCaT (Albay + F. + H.). Fluoresein sodyum tuzu DMEM + % 10 FCS ile verici madde olarak kullanılmıştır. Görüntü için analiz Hematoksilen ve Eozin (o) ile boyama kollajen hücre modeli kullanılmıştır. Bu boyama yapıldı üreticinin iletişim kuralını kullanarak. Şekil 5′ te, leke temsilcisi Albay + F. + H. modeli ile gösterilir. O biraz kollajen matris doku yapısını leke bırakır. Fibroblastlar matris içinde bulunan ve fibroblast ve HaCaT hücrelerinin çekirdekleri içinde koyu mor lekeli. Kollajen matris üstüne kapsayan bir katman modelinin üst kısmında bina HaCaTs, çekirdekleri olmalıdır birçok çekirdek içeren bir katman vardır. Tablo 5′ te, deneysel Permeasyon katsayıları ve simüle Difüzyon katsayıları listelenmektedir. Bir eğilim HaCaT olmayan modeller ile karşılaştırıldığında daha düşük Permeasyon/Difüzyon katsayıları var HaCaT, modelleriyle çoğu için görülebilir. 10,9 ,4, nüfuz katsayıları mutlak hatadır ve için Difüzyon katsayıları %5.2-% 12.9. Resim 1: bir membran geçirgenliği deneyde yan görünüm ekleme sistemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2: bir geçirgenlik deneyi örnek grafiğin. Alıcısı konsantrasyon zaman içinde çizilir. İki kesik çizgiler grafik yaklaşık doğrusal parçası braketi. Doğrusal bölümü eğimi permeabilite katsayısı belirlemek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: geometri ve membran mesh simülasyon sistemi takın. (bir) 96-şey zar geometrisini ekle sistem. (b) 12-şey zar geometrisini ekle sistem. (c) 96-şey zar Mesh ekle sistem. (d) 12-şey zar Mesh ekle sistem. (e) kesit ve membran parametreleri ekleme sistemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: Permeasyon deneme deneysel veriler için en iyi duruma getirilmiş simülasyon karşılaştırılması. (bir) fluoresein sodyum tuzu, (b) floresein isothiocyanate-dextran 4.000 mol WT, (c) 10.000 mol WT, (d) 20.000 mol WT ve (e) 40.000 mol WT Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: temsilcisi HE kollajen hücre modeli (kollajen + fibroblastlar + HaCaT) boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: permeabilite katsayısı 1/Stokes RADIUS fluoresein sodyum tuzu ve floresein isothiocyanate-dextran bir 96-şey zar kullanma bir fonksiyonu olarak ekleme sistemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Adı Experession için iyi sisteminde 96 mm 12-şey sistemi mm için Experssion Açıklama d_tran 5.65 [mm] 14,7 [mm] Kuyu çapı d_a 4.26 [mm] 12,1 [mm] Membran çapı d_w 8.79 [mm] 21,97 [mm] Alıcısı çapı h_b 2 [mm] 2 [mm] Yükseklik bariyer h_sp 1 [mm] 1 [mm] Mesafe arasında iyi ve alt h_a 4,73 [mm] 5.24 [mm] Alıcısı, yüksek b h_b/2 – Daldırma derinlik r ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) – RADIUS daldırma Ball+ r_z r + h_b – z-pozisyon daldırma topun+ Tablo 1: geometri parametreleri “Kimyasal türler taşıma” simülasyon için. + 96 şey zar jel sadece özel simülasyon için kullanılmak üzere sistem yerleştirin. Adı İfade Değer Açıklama C_fl 0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] 0.26576 mol/m2 Fl.So konsantrasyon. C_4 2 [mg/ml] / 4000 [g/mol] 0,5 mol/m2 FD 4.000 konsantrasyonu C_10 2 [mg/ml] / 10000 [g/mol] 0.2 mol/m2 FD 10.000 konsantrasyonu C_20 2 [mg/ml] / 20000 [g/mol] 0,1 mol/m2 FD 20.000 konsantrasyonu C_40 2 [mg/ml] / 40000 [g/mol] 0.05 mol/m2 FD 40.000 konsantrasyonu Dif_w 1e-9 [m ^ 2/s] 1e – 9m2/s Su karıştırma Difüzyon katsayısı Tablo 2: “Kimyasal türler taşıma” simülasyon fiziksel parametreleri. Adı İfade Açıklama C Acceptor(c) Alıcısı konsantrasyon tanımı D D_search * 1e-10 D faktör değişikliği Tablo 3: Parametreler için “En iyi duruma getirme” simülasyon. Nüfuz Permeabilite katsayısı (m/s) x 10-8 Difüzyon katsayısı (m/s2) x 10-10 Stokes yarıçap permeate (m) x 10-10 Fl.So. 4.79 ± 0,20 1,94 ± 0.34 5 FD 4.000 2.37 ± 0.31 0.65 ± 0,12 14 FD10, 000 1,67 ± 0,47 0.22 ± 0,02 23 FD 20.000 0.65 ± 0,30 0.29 ± 0,04 33 FD 40.000 0,27 ± 0,08 0.14 ± 0,02 45 Tablo 4: geçirgenliği ve Difüzyon katsayısı % 2 özel jel + bir 96-şey zar membran aracılığıyla farklı Stokes RADIUS içeren maddelerin ekleme sistemi. (fluoresein sodyum tuzu Fl. yani, FITC dextran = FD =). Modeli Permeabilite katsayısı (m/s) x 10-8 Difüzyon katsayısı (m/s2) x 10-10 Albay 2,18 ± 0,29 1.22 ± 0,06 Albay + F. 1.77 ± 0,38 0,93 ± 0,12 Albay + H. 1,64 ± 0,40 0,96 ± 0,05 Albay + F. + H. 1.65 ± 0.18 0,88 ± 0,11 Tablo 5: fluoresein sodyum tuzu kollajen hücre modeli bir 12 üzerinden geçirgenliği ve Difüzyon katsayısı-şey zar sistemi Ekle (Albay = kollajen, Fibroblast, H. F. = HaCaT =).

Discussion

Bu çalışmada bir membran üzerinde mühendislik bir doku yapısı sayesinde nüfuz ölçmek için geliştirilmiş bir yöntem belgeleri. Moleküler boyutları özel jel arasında değişen maddelerin nüfuz önce sınamak ve doğrulamak belgili tanımlık yöntem ve ilgili simülasyon için incelenmiştir. İyi küçük moleküller daha hızlı bir matris mesh (dışında jel filtrasyon geçirgenlik Kromatografi tarafından yürürlükte) üzerinden nüfuz bilinmektedir. Benzer gözlemler sklera26, insan epidermal membran27, insan derisi17ve sıçan cilt28aracılığıyla maddelerin boyutu-dışlama deneyler yapılmıştır. Geçirgenlik katsayıları ve karşılık gelen Stokes RADIUS (aynı Difüzyon oranı olarak açıklanan, genellikle etkili RADIUS molekülün daha küçük moleküller ile hareket eden sert kürenin yarıçapı) arasında ters bir ilişki gösterilmiştir 26 , 28ve benzer bir ilişki deneylerde farklı moleküler boyutta maddeler ile gözlenen. Geçirgenlik katsayıları 1/Stokes RADIUS komplo tarafından en küçük moleküler boyutta dört gruba üzerinden doğrusal bir ilişki bulundu (R2 0.93 =) (şekil 6). Bu önerilen yöntemi ile simüle geçirgenlik katsayıları gerçekçi bir aralıkta olduğunu gösterir.

Deneylerde %46.15 Franz Difüzyon hücre sistem10ile permeabilite deneyleri için rapor daha biraz daha büyük bir hatadır. Tek mantıklı açıklama floresein-isothiocyanate-hangi daha sonra ele dextran, boyut dağılımı olabilir.

Açıklanan yöntemi önemli avantajları Franz Difüzyon hücre sistemini kullanarak yöntemlere göre vardır. İlk olarak, kurulum daha küçüktür; deneyler ticari iyi plaka (∼ 13 cm x 8,5 cm) ölçeğe sahip doğrudan bir membran Ekle sistemi içinde yürütülür. Ayrı bir Franz Difüzyon hücresine her örnek için gereklidir, ancak bu aynı zamanda, çalıştırılacak birden çok örnekleri sağlar. İkinci olarak, bir deri model geçirgenliği nerede ekimi gerçekleşir membran INSERT doğrudan ölçülebilir. Franz Difüzyon hücreleri kullanarak, örnekleri çıkarıldı ve küçük örnekler için daha ağır olduğunu ve aynı zamanda daha uzun sürmesine sisteminde, monte gerekir.

Kollajen hücre matrisler ile nüfuz deneyler bu yöntem başarıyla cep numaralı seribaşı sistemlere uygulanması gösterdi. Burada sunulan model deri modelleri için doğrulandı; Ancak, yöntem organik hücre kültürleri, örneğin, böbrek veya karaciğer, diğer türleri için uygulanabilir.

Bu çalışmada, HaCaT hücreleri tamamen modeli yüzeyi kaplı bir kollajen-hücre modeli kullanılmıştır (bkz şekil 5). Permeabilite katsayısı, permeabilite katsayısı bir kollajen-hücre modeli olan ve olmayan HaCaT tabakası arasında ayırt etmek için hassas yöntemdir gösteren bir azalma olmuştur. İdeal olarak, bir deri model bir gerçek deri29epidermis yaklaşımları, bir bariyer kadar inşa etmeli ve bu nedenle gerçek kullanmadan önce cilt modeli kalitesini (örneğin, DermIS, epidermis bina) doğrulamak önemlidir. Bir deri model geliştirme teknikleri boyama ile görüntülenir ve cilt protein ve kollajen30,31,32algılama sayılabilir. Permeabilite katsayısı cilt modeli geliştirilmesi değerlendirmek için önemli bir faktör de kullanabilirsiniz, ancak daha fazla deneyler bundan emin olmak için gerekli. Daha önce belirtildiği gibi bu yöntem, paralel olarak birden çok örnekleri çalışan sağlar. Örnekleri geçirgenliği ölçmek ve böylece bu parametre cilt modelinin geliştirilmesi gözlemlemek için işleme sırasında almak mümkündür.

Geçirgenliği bir jel/kollajen-cep-model ve bir membran ile aynı anda ölçülen belirtmek gerekir. Algılanan permeabilite katsayısı sistem sayede farklı cilt modelleri sonuçlarını yalnızca aynı membran Ekle kullanırken karşılaştırılabilir, özeldir. Ayrıca, test madde yalnızca modeli aracılığıyla nüfuz ve değil yanındaki, hangi hataları ölçülen geçirgenliği ikna etmek sağlamak için tüm yetiştirme alanı kapsayacak şekilde cilt modeline ihtiyacı var. Gelecekte deneyler düşünülmesi gereken başka bir cilt çevreleyen doğal çevrenin yönüdür. Normalde, deri yüzey sıcaklığını Permeasyon koşulları etkileyebilecek iç bölge ile karşılaştırıldığında düşüktür.

Laboratuvar deneyleri bilgisayar simülasyonları ile hizalamak üzere uygulanan simülasyon için parametre optimizasyon sağlayan bir yöntem sunuldu. Simülasyonlar küçük moleküler boyutu olan maddeler için deneysel verilerle de aynı tarihte bulundu. Ancak, simülasyon ve deneysel veriler arasındaki sapmalar daha büyük moleküler boyutu olan maddeler için tespit edildi. Büyük polisakkarit moleküller sürtünme artırmak ve ağır bir jel Difüzyon sürecinde ol. Bu etkisi deneysel arasındaki olası bir neden olan anormal difüzyon, neden olur ve simülasyon değerlere33,34. Başka bir açıklama daha küçük veya daha büyük partiküller floresein-isothiocyanate-dextran varlığı olabilir. Üretici maddenin molekül ağırlığı ortalama boyutu ile bulunması daha küçük ve daha büyük partiküller sağlar belirli bir Aralık olarak belirtir. Daha küçük partiküller daha hızlı jel ve sıvı kanal nüfuz olarak da ne kadar dağınık bu maddelerin çoğu, belli değil. Bu Difüzyon ve sürtünme etkileri göz önünde bulundurulacak simülasyon uzatmak mümkündür.

Geçirgenlik deneyi ve simülasyon 2 kille olarak kullanılmak üzere geliştirilmiştir. Simülasyon yardımıyla, bu deneysel yöntem doğrudan daha sofistike deneysel kurulumları için transfer edilebilir. Örneğin, membran ekleme sistemi simülasyon geometri 2 OC veya benzer set-up diğer sistemlerle kolayca aktarılabilir. Simülasyon oransal bu seçeneği gelecekteki deneyler tasarımını desteklemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, yan etkileri buharlaşma, anormal Difüzyon ve membran efektler gibi böylece doğruluğu artırma simülasyon, geliştirmek için entegre edilebilir. Simülasyon programı değiştirmek veya simülasyon denklem cilt modeli geliştirme diğer yönleri araştırmak için fiziksel diğer modüller entegre olarak geliştirmek için fırsat verir. Bir örnek glikoz tüketimi ve laktat üretimi bir kollajen hücre modeli simülasyonudur.

Tıbbi maddeler test özellikle ilginç bir yönü maddeler bir organ-on-a-chip sisteminde nasıl dağıtıldığını var. Cevap için yardımıma sorular ne kadar hızlı gibi bir madde içine belgili tanımlık sistem nüfuz simülasyon ve geçirgenliği parametre yanı sıra hangi konsantrasyon diğer dokularda bir multi-organ-çip için geçerli olacak. Bu yöntem destek ve geliştirme ve sınama gibi organ-on-chip sistemleri geliştirmek.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser grant altında finansal destekle Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) No oluşturuldu PO413/12-1 ve LA 1028/7-1.

Materials

Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen  Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS  Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures – A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -. F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -. M., et al. The Multi-organ Chip – A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -. M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing – organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It “Normal”?. J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk’s guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Tags

Membrane Insert SystemPermeabilityDiffusionOrgan-on-a-chipAgarose GelCollagen Cell ModelKeratinocytesDonor SubstanceAcceptor SubstanceFluorescence Measurement

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hsu, H., Kracht, J., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image