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Bioengineering

Une méthode de détermination et de Simulation de perméabilité et de la Diffusion dans un modèle de tissu 3D dans une Membrane insérer système pour plaques multipuits

Published: February 23, 2018
doi:
10.3791/56412
, , , , , , ,
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering,Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology,Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

Summary

Une méthode de détermination de la perméabilité de la membrane insérer système pour plaques multipuits et in silico optimisation de paramètres pour le calcul des coefficients de diffusion à l’aide de la simulation sont présentés.

Abstract

Modèles de peau in vitro cultivées sont devenus de plus en plus pertinentes pour les applications pharmaceutiques et cosmétiques et sont également utilisés dans le développement de médicaments ainsi qu’aux essais de la substance. Ces modèles sont principalement cultivés dans les systèmes de membrane-insertion, leur perméabilité vers différentes substances étant un facteur essentiel. En général, les méthodes appliquées pour la détermination de ces paramètres exigent habituellement de grands échantillons (par exemple, la cellule de diffusion Franz) ou équipement laborieux (p. ex., récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP)). Cette étude présente une méthode de détermination des coefficients de perméabilité directement dans les systèmes de membrane-insert avec diamètre de corps de 4,26 et 12,2 mm (zone de production). La méthode a été validée avec agarose et gels collagène ainsi qu’un modèle de cellule de collagène représentant des modèles de peau. Les processus de perméation des substances avec différentes tailles moléculaires et perméation à travers des modèles de cellules différentes (composé de gel de collagène, fibroblaste et HaCaT) ont été décrites avec précision.

En outre, pour prendre en charge la méthode expérimentale qui précède, une simulation a été créée. La simulation s’insère les données expérimentales bien pour les substances dont la petite taille moléculaire, jusqu’à à 14 x 10-10 m rayon de Stokes (4 000 MW), et est donc un outil prometteur pour décrire le système. En outre, la simulation peut réduire considérablement les efforts expérimentaux et est assez robuste pour être reconduites ou adaptés à des configurations plus complexes.

Introduction

Organo-typiques cultures 3D sont devenus des outils puissants pour le développement de médicaments et de la substance test1. À cet égard, les modèles de peau humaine sont d’un intérêt particulier en raison des exigences réglementaires, telles que celles de la cosmétique. Ils ont ensuite conduit à l’élaboration de nombreux modèles de peau 3D, pour une utilisation soit sur leur propre comme culture unique-orgue en plaques multipuits, ou en multi-organes-copeaux en combinaison avec les modèles d’organes supplémentaires, par exemple, le foie2.

En ce qui concerne la culture d’un équivalent de la peau, l’interface air-liquide (ALI) est un élément essentiel pour la bonne différenciation épidermique3. Inserts de culture cellulaire, composés d’un récipient contenant une membrane perméable au liquide en bas sont généralement utilisés pour mettre en place un ALI. ALIs sont largement utilisés dans des modèles de peau disponible dans le commerce comme EpiDerm4, Phenion5et Episkin6, pour la culture des modèles de peau avec des tailles de 96 puits (4,26 mm de diamètre) jusqu’à plaques de 12 puits (12,2 mm de diamètre). La méthode décrite ici détermine la pénétration de substances dans un système d’insertion de membrane.

Le coefficient de perméabilité est un paramètre important pour évaluer la qualité de n’importe quel cultivée-modèle de peau contre peau native5et est utilisé pour évaluer la vitesse à laquelle les substances actives migrent à travers la peau. Surtout si les médicaments ou cosmétiques produits doivent être appliqués sur la peau, ce paramètre est essentiel de comprendre quand précisément les principes actifs passent par elle. Une simulation plus peut aider à prédire le comportement du système et de réduire par la suite l’effort expérimental de temps nécessaire, surtout lorsqu’un grand nombre de substances est impliqué.

La cellule de diffusion Franz est state-of-the-art pour perméation expérimente la peau et peau modèles5,6,7,8,9. Ce dispositif se compose de deux compartiments avec un échantillon fixe (barrière de diffusion) entre les deux. La substance d’essai est appliquée directement sur la partie supérieure de l’échantillon (compartiment donneur) et la concentration du composé PERMÉANTES peut être détectée dans le compartiment opposé à (accepteur). Du côté de l’accepteur, température constante et la concentration de la substance homogène sont assurées grâce à une chambre froide et un agitateur magnétique. Échantillons peuvent être prélevés à un échantillonnage du bras sur le côté de l’accepteur de la cellule de Franz. Avec une gamme de hauteur de 19 cm 179, ce système est relativement important de10,11. Une autre méthode pour la détermination des coefficients de diffusion des substances gélatineuse et de tissus est FRAP. Cette technique utilise le principe de blanchiment fluorescent étiqueté des particules dans le gel et puis en déterminant le temps de récupération de la zone blanchie pour calculer la diffusion coefficient12,13,14.

En outre, la spectroscopie Fourier transform-infrarouge (FTIR) peut servir à détecter le mouvement de la particule avec absorption de lumière infrarouge afin de déterminer le processus de percolation des substances dans la peau15,16. Cependant, ceux-ci ou autres méthodes d’imagerie (par exemple, de la spectroscopie par fluorescence biphotonique corrélation17) doivent coûter instruments intensives.

Dans cet article, on présente une méthode pour mesurer directement la perméabilité d’une barrière au sein d’un système d’insertion de membrane, où un modèle de peau peut être cultivé. Cette méthode permet aux expériences de perméabilité être exécuté avec un grand nombre de petits échantillons (bien taille vers le haut à 4,26 mm) dans un système compact. C’est contrairement à la cellule de diffusion Franz, où un dispositif distinct est nécessaire pour chaque sonde, ce qui doit être monté sur l’appareil et est difficile à réaliser pour les petits échantillons (taille de 4,26 mm). En outre, étant donné que la méthode ne nécessite pas de grands instruments (p. ex., un microscope confocal ou multiphoton), une réduction dans le temps et le coût est atteint.

Toutes les expériences ont été réalisées en membrane microporeuse insérer systèmes auprès d’un échantillon (barrière) consistant en gel d’agarose ou d’un modèle de cellules de collagène mis en place sur la membrane. Les substances fluorescentes (donneur) avec diverses tailles moléculaires ont été appliquées à la partie supérieure de l’échantillon et la concentration de substance perméabilisée a été détectée sur le fond (accepteur) à l’aide d’un lecteur de fluorescence (voir Figure 1). Afin de valider la méthode et de vérifier l’exactitude de cette simulation, les gels d’agarose ont été produits et utilisés comme une barrière. Les hydrogels sont généralement utilisés pour l’étude des processus de diffusion et de perméabilité dans un milieu poreux dans les sciences biologiques13. La méthode a été testée puis dans un système cellulaire graines consistant en une matrice de collagène de fibroblastes primaires et adultes faible Calcium haute température kératinocytes (HaCaT) des cellules humaines (modèle de cellule-matrice), qui est une peau simplifiée modèle18,19 .

En outre, le processus de percolation a été simulé au moyen de simulations de flux avec la dynamique des fluides computationnelle. Il a été constaté que, au moyen de l’optimisation des paramètres, le coefficient de diffusion pourrait être calculé à partir des données expérimentales. En général, cette simulation vous propose différentes applications ; par exemple, il est possible de prévoir un processus de perméation basé sur des expériences courtes et la simulation peut réduire considérablement le nombre d’expériences.

Simulation et méthode expérimentale ont été conçus pour l’application sur un système d’orgue-on-a-chip1,20,21, plus précisément le 2-orgue-puce (2-OC) développé commercialement1,22, 23,24,25. En principe, le processus de perméation de n’importe quel modèle d’orgue basé sur des systèmes de membrane insert peut être décrit de cette façon.

Protocol

1. préparation de l’échantillon pour les études de perméabilité Remarque : Afin de vérifier les mesures de perméation et des simulations, un échantillon consistant en gel d’agarose ou d’un modèle de matrice de cellule basée sur la culture du modèle de peau a été utilisé. Gel d’agarose Dissoudre 0,2 g de poudre de haute résolution d’agarose dans 10 mL d’H2O (eau bidistillée). Mélanger la solution et chauffer jusqu’à 80 ° C. Maintenir la température pendant 8 min. Appliquer le gel d’agarose à 28,6 µL sur la membrane du système insert membrane de 96 puits (4,26 mm de diamètre) ou utilisation 226 µL pour la membrane bien 12 Insérez (12 mm de diamètre) du système (par exemple, système Transwell). Attendre 10 min jusqu’à ce que le gel est solidifié. Gel de collagèneRemarque : Toutes les mesures sont effectuées dans des conditions stériles et les solutions sont conservées sur la glace pour ralentir la polymérisation du gel collagène. Mix 125 µL de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) avec 1 mL d’une solution de collagène R de 0,4 % (collagène de queue de rat). Titrer la solution avec 1 M NaOH (hydroxyde de sodium) (~ 6 µL) jusqu’à ce que la couleur du rouge de phénol passe du jaune au rouge. Ajouter 125 µL de Dulbecco Eagle modifié (DMEM) + 10 % de sérum de veau foetal (FCS) au gel de collagène et mélanger soigneusement avec un embout de la pipette. Appliquer 28,6 µL de gel de collagène à la membrane du système d’insertion 96 puits ou 226 µL pour le système d’insertion de 12 puits membrane. Laisser le gel dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 30 min. Modèle de cellules de collagène par les fibroblastesRemarque : Toutes les étapes sont exécutées dans des conditions stériles. Préparer les fibroblastes primaires 5-7 jours avant l’expérience. Cultiver les fibroblastes avec DMEM + 10 % FCS en flacons de culture cellulaire (75 cm2) et changer le milieu tous les 2-3 jours.Remarque : Selon le montage expérimental, un plus grand nombre de cellules peut être utilisé. Retirez le support du flacon de culture cellulaire (confluent de 80 %) et laver deux fois avec 10 mL (flacon de culture 75 cm (2) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 3 mL de 0,05 % trypsine / acide tétraacétique (EDTA) et incuber pendant 3 min à 37 ° C. Appuyez doucement sur le flacon de culture pour détacher les cellules de la surface. Arrêter la réaction en ajoutant 3 mL de DMEM + 10 % FCS. Transvaser la solution dans un tube à centrifuger. Centrifuger la suspension cellulaire à 120 x g, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 0,5 mL de DMEM + 10 % FCS. Compter les cellules et s’adapter à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL.Remarque : Les étapes suivantes sont exécutées sur la glace pour ralentir la polymérisation du gel collagène. Mix 125 µL de HBSS avec 1 mL d’une solution de collagène R de 0,4 %. Titrer la solution avec 1 NaOH M (~ 6 µL) jusqu’à ce que la couleur du rouge de phénol vire du jaune au rouge. Ajouter 125 µL de suspension cellulaire (DMEM + 10 % FCS + 0,5 x 106 cellules/mL) dans le collagène gel et mélanger soigneusement avec une pipette. Appliquer 28,6 µL de gel de collagène sur la membrane du système d’insertion 96 puits ou 226 µL pour le système d’insertion de 12 puits membrane. Laisser le gel dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 30 min. Appliquer 75 µL de DMEM + FCS de 10 % sur la surface du gel et 300 µL à la plaque réceptrice de la membrane de 96 puits insérer système. Pour la membrane de 12 puits inscrire système, utiliser un volume de 590 µL pour la surface et 1 846 µL pour la plaque réceptrice. Enlever le support de la surface du modèle matrice cellulaire (transport aérien) et incuber le modèle de matrice de cellule plus pendant 7 jours. Utilisez 100 µl de milieu sur le fond et changer le support de tous les jours. Modèle de cellules de collagène avec HaCaTRemarque : Toutes les étapes sont exécutées dans des conditions stériles. Préparer le HaCaT 5-7 jours avant les étapes suivantes. Cultiver le HaCaT avec DMEM + 5 % FCS dans un flacon de culture cellulaire (75 mm2) et changer le milieu tous les 2-3 jours.Remarque : Selon le montage expérimental, un plus grand nombre de cellules peut être utilisé. Retirer le support de la fiole et laver deux fois avec 10 mL (flacon de culture 75 cm (2) de PBS. Ajouter 3 mL de 0,05 % trypsine/EDTA et incuber pendant 10 min à 37 ° C. Arrêter la réaction avec 3 mL de DMEM + 10 % FCS. Transvaser la solution dans un tube à centrifuger. Centrifuger la suspension cellulaire à 120 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 0,5 mL de DMEM + 10 % FCS. Compter les cellules et s’adapter à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL.Remarque : Les étapes suivantes sont exécutées sur la glace pour ralentir la polymérisation du gel collagène. Mix 125 µL de HBSS avec 1 mL d’une solution de collagène R de 0,4 %. Titrer la solution avec 1 NaOH M (~ 6 µL) jusqu’à ce que la couleur du rouge de phénol vire du jaune au rouge. Ajouter 125 µL de DMEM + 10 % FCS dans le gel de collagène et mélanger soigneusement avec une pipette. S’applique à 28,6 µL de suspension cellulaire sur la membrane du système d’insertion 96 puits ou 226 µL pour le système d’insertion de 12 puits membrane. Laisser le gel dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 30 min. Appliquer de 75 µL de suspension cellulaire à la surface du gel et ajouter 300 µL de DMEM + 10 % FCS à la plaque réceptrice de la membrane de 96 puits insérer système. Pour la membrane de 12 puits insérer système, utilisez un volume 590 µL de suspension de cellules à la surface et 1 846 µL de DMEM + 10 % FCS pour la plaque réceptrice. Incuber le modèle de matrice de cellules pendant 3 jours ; après 2 jours d’échange le milieu. Enlever le support de la surface du modèle matrice cellulaire et laisser incuber le modèle de matrice de cellules de plus de 7 jours. Utilisez 100 µl de milieu sur le fond et changer le support de tous les jours. Modèle de cellules de collagène par les fibroblastes et HaCaTRemarque : Toutes les étapes sont exécutées dans des conditions stériles sur la glace pour ralentir la polymérisation du gel collagène. Préparer les fibroblastes comme décrit dans l’étape 1.3 jusqu’à l’étape 1.3.5 et préparer un jour plus tard HaCaT comme décrit dans étape 1.4 jusqu’à l’étape 1.4.4. Mix 125 µL de HBSS dans 1 mL de solution de collagène R de 0,4 %. Neutraliser la solution avec 1 NaOH M (~ 6 µL) jusqu’à ce que la couleur du rouge de phénol varie de jaune à un violet rouge. Ajouter 125 µL de la suspension de cellules de fibroblaste primaire consistant en DMEM + 10 % FCS + 0,5 x 106 cellules/mL de collagène gel et mélanger soigneusement. S’applique à 28,6 µL de suspension cellulaire à la membrane du système d’insertion 96 puits ou 226 µL pour le système d’insertion de 12 puits membrane. Laisser le gel dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 30 min. Ensuite, appliquez 75 µL de DMEM + FCS de 10 % sur la surface du gel et 300 µL sur la plaque réceptrice du système insert membrane de 96 puits. Pour la membrane de 12 puits insérer système, un volume de 590 µL est utilisé pour la surface et 1 846 µL pour la plaque réceptrice. Incuber pendant 1 jour à 37 ° C et 5 % de CO2. Enlever le support de la surface et ajouter une suspension de cellules HaCaT avec 0,5 x 106 cellules/mL. Le volume est identique à celui décrit avant sous étape 1.5.6. Incuber le modèle de matrice de cellules pendant 3 jours ; après 2 jours d’échange le milieu. Enlever le support de la surface du modèle matrice cellulaire et laisser incuber le modèle de matrice de cellules de plus de 7 jours. Utilisez 100 µl de milieu sur le fond et changer le support de tous les jours.Remarque : Pour cette enquête, 3 gel/cellule-modèle échantillons ont été préparés pour le système d’insertion de 12 puits membrane. Pour la membrane de 96 puits insérer le système, nous avons utilisé 6 échantillons pour le modèle de gel/cellule. Pour les moyens statistiques, 3 échantillons sont communs. Mais pour les expériences dans le système d’insertion de membrane de 96 puits avec modèle de matrice de collagène nous attendions les échecs et les écarts pour la culture cellulaire. Par conséquent, nous avons choisi un plus grand nombre d’échantillons. 2. perméabilité des études dans la Membrane insérer système Substance de donateursRemarque : Les deux sels de sodium de fluorescéine (NaFl) sont produites. Dissoudre NaFl H2O à une concentration de 0,1 mg/mL et 0,01 mg/mL. L’isothiocyanate de fluorescéine différents-dextranes (FD) avec un poids moléculaire de 4 000, 10 000, 20 000 et 40 000 g/mol sont dissous dans H2O à une concentration de 2 mg/mL. Utilisez ces solutions comme substance de bailleurs de fonds pour les expériences de perméabilité (voir Figure 1) avec le gel d’agarose. Pour la configuration du modèle de cellule de collagène, préparer toutes les solutions avec DMEM + FCS de 10 % au lieu de l’eau.NOTE : Préparer des solutions (10 x plus forte concentration) de la substance du donneur. Faibles variations de la concentration de donateurs peuvent influencer les résultats de l’essai de perméabilité. Méthode expérimentaleRemarque : L’expérience de perméabilité est exécuté à 37 ° C et une humidité de > 90 %. Ce paramètre garantit la viabilité des cellules. La température influence le processus de diffusion pour les mêmes paramètres sont utilisés pour les expériences avec le gel d’agarose, gel de collagène et modèle de cellules de collagène. Les informations de volume dans le support fait référence à du système d’insert 12 puits. Préparer une membrane bien 96 (ou 12) système d’insert avec une barrière constituée d’agarose gel (voir protocole 1.1) ou modèle de cellules (voir protocole de 1,2 à 1,5) et la substance de donneur de fluorescence. Préparer des dilutions de 01:10, 01:20, 01:40, 1 : 80, 1 : 160 et 1/320 de la substance de donateurs pour établir une courbe d’étalonnage. Distribuer 300 µL (1 846 µL) de chaque dilution dans trois puits de la plaque réceptrice. Pour la membrane de 12 puits insérer le système, utilisez une plaque de réception séparée. Les dilutions en série sont utilisées pour convertir la concentration équivalente [mg/mL] de la fluorescence mesurée [RFU]. Ajouter 75 µL (590 µL) de substance de donneur sur le dessus de l’échantillon (agarose gel ou cellule modèle) et 300 µL (1 846 µL) de substance de l’accepteur (H2O ou DMEM + 10 % FCS) dans la plaque réceptrice (voir Figure 1).Remarque : Assurez-vous que la surface du liquide dans la membrane insérer système et dans la plaque réceptrice disposent du même niveau pour éviter une pression hydrostatique. Transfert de l’ensemble du système sur un agitateur dans l’incubateur. Ajuster la secousse pour obtenir un mélange homogène (orbite de course totale est de 1,5 mm, la vitesse est réglée au niveau 3.5, qui est liée à une rotation de ~ 480 1/min) pour éviter un gradient de concentration, ce qui influe sur le processus de diffusion. Déterminer la fluorescence périodiquement toutes les heures. Pour mesurer la fluorescence, transfert du système d’insert dans une assiette vide et mesurer la fluorescence dans le récepteur à l’aide d’un lecteur. Utiliser une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et d’émission de 535 nm de fluorescéine. Exécutez l’expérience pendant 5 h.Remarque : Au cours des expériences, le liquide s’évapore de l’ensemble du système. L’évaporation modifie la concentration dans le donneur et l’accepteur et influe sur les résultats. Cet effet est négligé dans le cas d’une durée de 5 h, mais pour les longs en cours d’exécution, qu’il convient de considérer. Calcul du coefficient de perméabilité Pour tracer la courbe d’étalonnage, tracer la fluorescence de la série de dilutions contre la concentration et effectuer une régression linéaire sur les données. La pente de la régression linéaire permet de convertir les données de fluorescence de l’expérience de la perméation de concentration. Dans le but de la simulation, convertir les unités en mol/m3. Tracer la concentration en fonction au fil du temps et établir le segment linéaire des données (voir Figure 2). Déterminer la pente de cette partie linéaire et calculer le coefficient de perméabilité selon l’équation suivante (Voir l’exemple à la Figure 2) :où dcA/ dt est la variation de la concentration de la substance dans le côté accepteur au fil du temps (la pente) ; CD est la concentration du côté du donneur ; P est le coefficient de perméabilité ; A est la surface de perméation et VA est le volume de l’accepteur. Cette équation est dérivée de la première loi de Fick et ne peuvent être appliqués lorsque CD » CA6,22. Remarque : Les concentrations chez le donneur doivent être beaucoup plus élevée que la concentration détectée dans l’accepteur. Cela a été vérifié dans les paramètres expérimentaux. 3. simulation Remarque : La simulation a été faite avec COMSOL Multiphysics 5.1. Une connaissance de base de ceci est supposée. Pour la simulation de la diffusion, les hypothèses suivantes : (a) le coefficient de diffusion des substances dans l’H2O est beaucoup plus élevé par rapport à celle dans le gel. Pour compenser cette différence, cette simulation utilise une valeur de 1 x 10-9 m2/s qui est plus élevé par un facteur de 10 pour 100 par rapport au coefficient de diffusion de NaFl par le biais de gel d’agarose à 2 %. (b) dans l’expérience, la substance se diffuse à travers la barrière et système Insérez ensuite à travers la membrane de la membrane. À la différence du montage expérimental, la matrice de gel ou de la cellule d’agarose virtuel et la membrane sont considérés comme être une phase homogène. (c) effets de frontière sur les murs sont réglés sur « pas de bordereau », tout effet glissant sur les murs (pas entre liquide, gel ou liquide et cellule modèle) du système insert membrane sont négligés et ne sont pas significatifs pour le processus de diffusion. Configuration de la simulation de la diffusionRemarque : Ces étapes montrent la configuration de la simulation de l’expérience de perméabilité. Les simulations pour les systèmes d’insertion de membrane 96 et 12-puits ont été mises en place séparément. Le module « Transport d’espèces chimiques » utilise une équation basée sur la seconde loi de Fick de la diffusion :où c est la concentration de la substance, t est le temps, u est la vitesse, D est le coefficient de diffusion, et R est le taux de réaction. La vitesse de la réaction a été négligée car aucune réaction chimique s’est produite dans le processus de diffusion. Ouvrez le programme et commencer un nouveau modèle. Choisir le « modèle Wizard », sélectionnez la 3D modèle, ajouter « Transport de dilué espèces » à l’interface de la physique dans le menu déroulant, cliquez sur « Étude », sélectionnez l’étude « Temps dépendant » et cliquez sur « Done ». Allez dans les définitions de « Global » et ajouter « Paramètres » avec clic droit. Entrez les paramètres géométriques et physiques dans la grille (voir tableau 1, tableau 2et Figure 3e).Remarque : La surface concave du gel d’agarose dans un système d’insertion de membrane de 96 puits a été approchée avec un ballon d’immersion. Mettre en place la géométrie du système insert membrane à l’expérimentation. À l’étape 3.2, un exemple est illustré de la façon de construire la géométrie du système insert membrane de 96 puits. L’unité de longueur est définie au compteur.Remarque : Ne pas construire la géométrie complète pour gagner du temps de calcul. Au lieu de cela, la géométrie peut être réduite en utilisant des traits d’axe d’un quart de la géométrie (voir les figures 3 a et 3 b de la Figure). Ajoutez deux « domaine sondes » dans « Définitions » (droite cliquez sur « Définitions » et recherchez « Sonde ») et sélectionnez une sonde comme le domaine de l’accepteur et l’autre comme étant l’apanage des donateurs. Choisir pour les deux de type « Moyen » et l’expression « c » avec l’unité « mol/m3».Remarque : Cette étape est facultative et indique la concentration du donneur et accepteur pendant la simulation. Définir le coefficient de diffusion (Dc) dans « Propriétés de Transport 1 » dans le « Transport d’espèces dilué « comme « Dif_w ».NOTE : « Propriétés de Transport 1 » sont utilisées pour domaine fois donneur et accepteur. Dans l’étape suivante, le domaine de la barrière sera remplacé. Ajoutez un second clic « Propriétés de Transport 2 » droit sur « Transport d’espèces dilué » et sélectionnez la barrière (2) dans la « sélection du domaine ». Selon l’objectif de la simulation, le coefficient de diffusion peut être défini comme une valeur de la barrière ou comme une variable binaire « D ». Pour la première série de tests, définissez une valeur de 2E-10 m2/s.NOTE : « D » sera déclaré plus tard à l’étape 3.3. « Transport de dilué espèces » pour « valeurs initiales 1″ définissent la concentration zéro.NOTE : « Initial Values 1 » est utilisé pour barrière et l’accepteur de domaine. Dans l’étape suivante, le domaine de donateurs est écrasé. Ajouter un second clic « Valeurs initiales 2 » droit sur « Transport d’espèces dilué » et sélectionnez le donateur (3) comme le domaine. Définir la concentration comme la concentration initiale de la substance du donateur (par exemple, C_fl du tableau 2). Ajouter « Symétrie 1 » avec un clic droit sur « Transport d’espèces dilué », d’ajouter et de choisir toutes les surfaces de la « sélection de limite », qui reflètent la géométrie complète (par exemple la géométrie à l’étape 3.2, il est à la limite nombre 1, 2, 4, 5, 7, 8).NOTE : Ce point peut être négligé si la géométrie complète a été mises en place. Avec un clic droit sur « Mesh » ajouter deux « gratuit tétraédrique ». Sélectionnez la barrière (2) que le domaine (changement de niveau de l’entité géométrique dans « Domaine »). Ajouter « Size » avec un clic droit sur « Free Tetrahedral 1″ et pour le maillage prédéfini plus « fine » pour la membrane de 12 puits insérer système ou « extra fin » pour une membrane de 96 puits insérer système. Dans le deuxième « gratuit tétraédrique » sélectionnez l’accepteur et le donneur comme domaine et le maillage prédéfini « Normal » pour une membrane de 12 puits insèrent système ou plus « fine » pour une membrane de 96 puits insérer système (voir Figure 3C et 3d de la Figure).Remarque : Il est également possible de choisir un maillage plus grossier pour gagner du temps de calcul. Cela pourrait réduire la précision des résultats. Cliquez sur « Build All » dans « Réglage de Mesh » pour la géométrie de maille. Commencer la simulation avec « compute » dans le « étude 1″. Exemple de réglage pour une géométrieNOTE : Ici, un exemple est donné de la façon de mettre en place la géométrie du système insert membrane de 96 puits (avec barrière concave). Toutes les étapes sont exécutées dans le module de géométrie du programme. L’unité de longueur est définie au compteur. Générer un cylindre 1 (clic droit sur « Géométrie 1 ») de rayon de d_w/2 et hauteur de h_sp + h_b + dejlal. Générer un cylindre 2 de rayon de d_tran/2, hauteur de position h_b + dejlal et z de h_sp. Utilisez l’option « Différence » (faites un clic droit sur « géométrie 1″, recherchez « Booléens et Partition ») à soustraire le cylindre 2 du cylindre 1. Choisir « cyl1 » dans les « objets d’ajouter, » activer « Objet de soustraire » et a choisi « cyl2 ». Le nouveau volume est la géométrie de l’accepteur. Générer un cylindre 3 avec rayon de d_a/2, hauteur de h_b et la position z du h_sp. Générer une sphère 1 avec rayon r et z position r_z. Utilisez l’option « Différence » pour soustraire la sphère 1 (sph1) du cylindre 3 (cyl3). Le nouveau volume est appelé différence 2. Générer un cylindre 4 avec rayon de d_a/2, hauteur h_b + dejlal et la position z du h_sp. Utilisez l’option « Différence » pour soustraire le cylindre 4 (cyl4) de différence 2. Le nouveau volume est la géométrie de l’accepteur. Répétez les étapes 3.2.4-3.2.6 pour la construction de la barrière (agarose gel ou cellule modèle dans l’expérience). Faire une union 1 de tous les éléments de géométrie (à droite, cliquez sur « Géométrie 1 », recherchez « Booléens et Partition »). Générer un bloc 1 avec tous les bords sur une longueur de d_tran * 2, position x – y de d_tran et de d_tran * 2. Générer un bloc 2 avec toutes les longueur d’arête de d_tran * 2, position x de – d_tran * 2 et y de – d_tran. Utilisez l’option « Différence » pour soustraire l’union 1 bloc 1 et bloc 2. Ajout de l’optimisation des paramètres pour la SimulationRemarque : Avec l’aide de l’optimisation du paramètre, le coefficient de diffusion peut être monté aux données expérimentales générées précédemment. Les instructions suivantes montrent comment intégrer la partie optimisation dans la simulation de la diffusion. Assurez-vous que la simulation de la diffusion fonctionne avant de commencer les étapes ci-dessous. Ajouter le Module physique « Optimisation », à l’aide de « Ajouter Physic » (optimisation peut être trouvée dans « Mathématiques » dans la catégorie « Optimisation et sensibilité ») à la simulation. Cliquez sur « Ajouter au composant ». Ajouter « Variables » avec clic droit sous « Définitions » (local dans le composant) et tapez dans les variables du tableau 3.Remarque : L’optimisation du paramètre utilise des nombres réels, c’est-à-dire, le facteur 1-10 du coefficient de diffusion doivent être définies séparément. Ajouter une « moyenne 1 » avec un clic droit sur « Définitions » dans la section « Composant de serrage » et le type dans le nom de l’opérateur « Accepteur ». Générer un document texte distinct contenant les données expérimentales.Remarque : Un point-virgule sépare les colonnes ; un saut de ligne sépare les lignes. Déclaration de temps est mesurée en secondes, la concentration en mol/m3. Supprimez le premier et les données deuxième point dans la phase de latence (voir Figure 2) des expériences pour éviter les erreurs de montage possible. Voici un exemple de comment le document texte pourrait ressembler :3540 ;      0.002167140 ;      0.0072412240 ;    0.0170715180 ;    0.0223018660 ;    0.0269721540 ;    0.02931Cet exemple peut servir à tester la simulation. Ajouter « Global objectif des moindres carrés » avec un clic droit sur « Optimisation », de fixer le document texte à l’étape 3.3.4 aux « données expérimentales » et de définir la première colonne comme « colonne Time 1″ avec la droite cliquez sur « Objectif Global des moindres carrés » et la deuxième colonne comme « Valeur de colonne 1 » avec un clic droit sur « Objectif Global des moindres carrés ». Dans le « Expression » de la « Colonne de valeur » type de la variable « C ». Ajouter « Contrôle des Variables globales 1 » avec un clic droit sur « Optimisation » et déclarent une variable dont la valeur initiale « 1 », limite inférieure « 0 » et limite supérieure « 1000 » « D_search ». Ajouter « Optimisation » avec un clic droit sur « étude 1″et choisi « SNOPT » comme une méthode d’optimisation du solveur. Ensemble la tolérance d’optimalité à 1E-9.Remarque : Si la simulation ne pas converger, augmenter la tolérance de l’optimalité. N’oubliez pas que la simulation est fausse si la tolérance de l’optimalité est trop grande. Démarrez l’optimisation du paramètre avec « compute » dans « study ». N’oubliez pas de définir le coefficient de diffusion sur la barrière « D ».

Representative Results

Expériences de perméabilité de la membrane de 96 puits insérer système avec du gel d’agarose à 2 % comme une barrière ont été menées afin d’évaluer l’exactitude d’une simulation. Sel de sodium de fluorescéine (NaFl) et fluorescéine isothiocyanate-dextranes (FD) ont servi à vérifier l’impact de la taille moléculaire de la substance de diffusion de 5 x 10-10 m vers le haut à 45 x 10-10 m rayon de Stokes (376.27-40 000 mol wt). Optimisation de paramètres native de la simulation a été utilisée pour ajuster la simulation aux données expérimentales. À cette fin, pentes d’uniquement les éléments linéaires de la perméabilité simulée ont été comparés aux résultats expérimentaux. De petite taille moléculaire, simulation et les données expérimentales sont en bon accord avec 99,2 % pour NaFl et 80,2 % pour FD 4 000 (voir Figure 4 a et 4 b de la Figure). Plus grande taille moléculaire générée déviations supérieures montrant les corrélations de 50,5 % pour 10 000 FD, 79,7 % pour 20 000 FD et 53,6 % pour 40.000 FD. Courbe de progression dans les simulations ont montré un retard au début et à une hausse plus forte dans le cours des graphes (voir Figure 4 c–4e). Coefficients de perméabilité et de coefficients de diffusion simulées sont indiquées en tableau 4. Le coefficient de perméabilité diminue avec l’augmentation de la taille moléculaire. Écart-type est entre 0,08 x 10-8 m/s et 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), qui correspond à une erreur absolue d’entre 4,18 % et 46,15 %. Expériences avec des molécules plus grosses ont montré une plus grande erreur absolue. Les coefficients de diffusion simulées se sont comportés très similaire aux coefficients de perméabilité expérimentale. Substances à plus grand rayon de Stokes a montré baisse des coefficients de diffusion et l’erreur absolue variait de 9,09 % à 18.46 % (N = 3). Dans les expériences de perméation supplémentaires, quatre types de modèles de cellule de collagène différents furent utilisés comme barrières dans une membrane de 12 puits insérer système. Ces modèles comprennent un modèle acellulaire et un modèle de cellule avec différentes combinaisons de fibroblastes primaires dans le gel de collagène et HaCaT sur la surface. Les combinaisons suivantes ont été utilisés : collagène (colonel) comme un modèle acellulaire, collagène + fibroblastes (col. + F.), HaCaT (col. + H.) et collagène + fibroblastes, collagène + HaCaT (col. + F. + H.). Sel de sodium de fluorescéine avec DMEM + FCS de 10 % a été utilisé comme substance de donateurs. Image pour l’analyse du modèle de cellule de collagène, coloration à l’hématoxyline et éosine (HE) a été utilisée. Cette coloration a été faite à l’aide du protocole par le fabricant. Dans la Figure 5, montre une telle tache avec un modèle représentatif du colonel + F. + H.. Le HE taches légèrement la structure tissulaire de la matrice de collagène. Les fibroblastes sont situés dans la matrice, et les noyaux des fibroblastes et les cellules HaCaT sont colorés en violet foncé. Sur le dessus de la matrice de collagène, il y a une couche contenant plusieurs noyaux, qui devraient être le noyau de la HaCaTs, création d’une couche englobante sur le dessus du modèle. Dans le tableau 5, coefficients de perméation expérimentale et des coefficients de diffusion simulées sont répertoriés. Une tendance est visible pour la plupart des modèles avec HaCaT, qui ont des coefficients de percolation/diffusion plus faibles en comparaison avec les modèles sans HaCaT. L’erreur absolue des coefficients de perméation est 10,9-24,4 % et pour la diffusion coefficients de 5.2 à 12,9 %. Figure 1 : vue latérale de l’expérience de la perméabilité de la membrane insérer système. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : graphique exemplaire d’une expérience de perméabilité. La concentration de l’accepteur est tracée au fil du temps. Support de deux lignes en pointillés la partie quasi linéaire de la courbe. La pente de la partie linéaire est utilisée pour déterminer le coefficient de perméabilité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : géométrie et mesh de la membrane insérer système dans la simulation. (a) la géométrie de la membrane de 96 puits système d’insert. (b), à la géométrie de la membrane de 12 puits insert système. système d’insertion (c), à la maille de la membrane de 96 puits. (d), à la maille de la membrane de 12 puits insert système. (e) paramètres de la membrane et la section insèrent système. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : comparaison des données expérimentales d’une expérience de perméation à la simulation optimisée. (un) sel de sodium de fluorescéine, (b) fluorescéine isothiocyanate-dextran 4 000 mol en poids, poids mol (c), 10 000, (d) 20 000 mol en poids et en poids mol de (e), 40 000 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : représentant HE coloration d’un modèle de cellules de collagène (fibroblastes, collagène + HaCaT). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : coefficient de perméabilité en fonction du rayon 1/Stokes à l’aide de sel de sodium de fluorescéine et fluorescéine isothiocyanate-dextran dans une membrane de 96 puits insérer système. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Nom Expression pour 96 système bien en mm Experssion pour système de 12 puits en mm Description d_tran 5.65 [mm] 14,7 [mm] Diamètre du puits D_A 4.26 [mm] 12.1 [mm] Diamètre de la Membrane D_W 8,79 [mm] 21.97 [mm] Diamètre de l’accepteur h_b 2 [mm] 2 [mm] Hauteur de la barrière h_sp 1 [mm] 1 [mm] Distance entre les deux bien et en bas dejlal 4,73 [mm] 5.24 [mm] Forte de l’accepteur b h_b/2 – Profondeur d’immersion r ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) – Rayon de la boule d’Immersion+ r_z r + h_b – z-Position de la balle d’Immersion+ Tableau 1 : paramètres de géométrie de simulation « Transport d’espèces chimiques ». + Uniquement pour être utilisé pour la simulation d’agarose gel dans 96 membrane bien insérer système. Nom Expression Valeur Description C_fl 0,1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] 0.26576 mol/m2 Concentration de Fl.So. C_4 2 mg/ml [] / 4000 [g/mol] 0,5 mol/m2 Concentration de FD 4.000 C_10 2 mg/ml [] / 10000 [g/mol] 0,2 mol/m2 Concentration de FD 10.000 C_20 2 mg/ml [] / 20000 [g/mol] 0.1 mol/m2 Concentration de FD 20.000 C_40 2 mg/ml [] / 40000 [g/mol] 0,05 mol/m2 Concentration de FD 40.000 Dif_w 1e-9 [m ^ 2/s] 1e – 9m2/s Coefficient de diffusion de l’eau de gâchage Tableau 2 : Paramètres physiques pour la simulation de « Transport des espèces chimiques ». Nom Expression Description C Acceptor(c) Définition de la concentration de l’accepteur D D_search * 1e-10 Changement de facteur pour D Tableau 3 : Paramètres pour la simulation de le « Optimisation ». Perméat Coefficient de perméabilité (m/s) x 10-8 Coefficient de diffusion (m/s2) x 10-10 Rayon de Stokes de perméat (m) x 10-10 Fl.So. 4.79 ± 0,20 1.94 ± 0,34 5 FD 4 000 2,37 ± 0,31 0,65 ± 0,12 14 FD10, 000 1,67 ± 0,47 0.22 ± 0,02 23 FD 20 000 0,65 ± 0,30 0,29 ± 0,04 33 FD 40 000 0,27 ± 0,08 0,14 ± 0,02 45 Tableau 4 : coefficient de perméabilité et de la diffusion de substances avec rayon de Stokes différent par le biais de gel d’Agarose à 2 % + membrane dans une membrane de 96 puits insérer système. (sel de sodium de fluorescéine = Fl. So., fitc dextran = FD). Modèle Coefficient de perméabilité (m/s) x 10-8 Coefficient de diffusion (m/s2) x 10-10 Col. 2.18 ± 0,29 1.22 ± 0,06 Le colonel + F. 1,77 ± 0,38 0,93 ± 0,12 Le colonel + H. 1,64 ± 0,40 0,96 ± 0,05 Le colonel + F. + H. 1,65 ± 0,18 0,88 ± 0,11 Tableau 5 : coefficient de perméabilité et de la diffusion du sel de sodium de fluorescéine à travers un modèle de cellules de collagène dans un 12-membrane bien insérer système (col = collagène, F. = fibroblastes, H. = HaCaT).

Discussion

Cette étude documente une méthode mise au point afin de quantifier la perméation à travers un tissu-construct conçu sur une membrane. Perméation de substances avec diverses tailles moléculaires par gel d’agarose a d’abord examinée pour tester et valider la méthode et la simulation correspondante. Il est bien connu que les molécules plus petites imprègnent plus vite au travers d’une maille de matrice (à l’exception de l’effet de filtration sur gel par chromatographie de perméabilité). Des observations similaires ont été faites avec des expériences d’exclusion stérique des substances à travers la sclère26, membrane épidermique humain27,17de la peau humaine et rat peau28. Une corrélation inverse entre les coefficients de perméabilité et le rayon de Stokes correspondant (le rayon d’une sphère dure qui se déplace avec le même taux de diffusion que les molécules décrites, généralement plus petits que le rayon effectif de la molécule) a été établi 26 , 28et une relation similaire a été observé dans des expériences avec des matières de différentes tailles moléculaires. En traçant les coefficients de perméabilité sur rayon 1/Stokes, a trouvé une corrélation linéaire sur les quatre groupes avec la plus petite taille moléculaire (R2 = 0,93) (Figure 6). Cela montre que les coefficients de perméabilité simulé avec la méthode proposée sont dans une gamme réaliste.

L’erreur de 46,15 % dans les expériences est légèrement plus grand que celles rapportées pour des expériences de perméabilité avec le Franz diffusion cellulaire système10. Une explication possible pourrait être la distribution granulométrique de fluorescéine-isothiocyanate-dextran, dont nous parlerons plus tard.

La méthode décrite a importants avantages comparativement aux méthodes utilisant le système de cellule de diffusion Franz. Tout d’abord, la configuration est plus compacte ; les expériences sont exécutés directement dans un système d’insertion de membrane, qui a l’échelle d’une plaquette commerciale bien (∼ 13 cm x 8,5 cm). Cela permet à plusieurs échantillons à exécuter simultanément, alors qu’une cellule de diffusion Franz distincte est nécessaire pour chaque échantillon. Deuxièmement, la perméabilité d’un modèle de peau peut être mesurée directement à l’insertion de la membrane, où la culture se déroule. À l’aide de cellules de diffusion Franz, les échantillons doivent être sortis et monté sur le système, qui est plus lourde pour les petits échantillons et aussi plus de temps.

Expériences de perméation avec matrices de cellules de collagène ont montré que cette méthode peut être appliquée avec succès aux systèmes cellulaires graines. Le modèle présenté ici a été vérifié pour les modèles de peau ; Toutefois, la méthode peut être appliquée à d’autres types de cultures de cellules organiques, par exemple, des reins ou du foie.

Dans cette étude, a utilisé un modèle de collagène-cellule dans laquelle les cellules HaCaT entièrement recouvert la surface du modèle (voir Figure 5). Cela a conduit à une réduction du coefficient de perméabilité, ce qui démontre que la méthode est suffisamment sensible pour distinguer le coefficient de perméabilité entre un modèle de collagène-cellule avec et sans une couche de HaCaT. Dans l’idéal, un modèle de peau devrait constituer une barrière, qui s’approche de l’épiderme d’une peau réelle29, et il est donc important de vérifier la qualité (p. ex., bâtiment du derme, épiderme) du modèle de peau avant l’utilisation effective. L’élaboration d’un modèle de peau peut être visualisée à l’aide des techniques de coloration et quantifiée de la détection de la peau collagène et les protéines30,31,32. Le coefficient de perméabilité peut aussi être un facteur important pour évaluer l’évolution du modèle de peau, mais les autres expériences sont nécessaires pour confirmer cela. Tel que mentionné précédemment, cette méthode permet de multiples échantillons en cours d’exécution en parallèle. Il est également possible de prélever des échantillons au cours de la culture pour mesurer la perméabilité et ainsi observer le développement de ce paramètre du modèle de peau.

Il est à noter que la perméabilité est mesurée grâce à un gel/collagène-cellule-modèle et d’une membrane en même temps. Le coefficient de perméabilité détecté est spécifique au système, auquel cas les résultats des modèles de peau différente ne peuvent être comparés que lorsque vous utilisez le même foyer de membrane. En outre, le modèle de peau a besoin couvrir la zone de culture ensemble afin de s’assurer que la substance d’essai imprégnera uniquement via le modèle et pas adjacents à celui-ci, qui induirait erreurs dans la perméabilité mesurée. Un autre aspect qui devrait être considéré à l’avenir des expériences est l’environnement naturel qui entoure la peau. Normalement, la température de la surface de la peau est plus faible en comparaison de la région, qui peut influencer les conditions de perméation.

Afin d’aligner les expériences en laboratoire avec des simulations informatiques, une méthode qui permet l’optimisation des paramètres pour la simulation appliquée a été présentée. Des simulations ont été trouvées à coïncident bien avec les données expérimentales pour les substances dont la petite taille moléculaire. Les écarts entre la simulation et les données expérimentales ont cependant étaient observées pour les substances dont la taille moléculaire. Molécules de polysaccharides grand peuvent augmenter la friction et ralentir le processus de diffusion dans un gel. Cet effet provoque la diffusion anormale, qui est une raison possible de l’écart entre expérimentale et simulation des valeurs33,34. Une autre explication serait la présence de particules plus petites ou plus grandes en fluorescéine-isothiocyanate-dextran. Le fabricant spécifie le poids moléculaire de la substance comme la taille moyenne avec une plage donnée, ce qui permet à des particules plus petites et plus grandes d’être présent. On ignore également comment dispersées ces substances sont, comme les particules plus petites imprègnent plus rapidement à travers le gel et le canal de fluide. Il est possible d’étendre la simulation afin d’étudier ces diffusion et les effets de la friction.

L’expérience de la perméabilité et la simulation ont été développés pour une utilisation dans un 2-oC. Avec l’aide de la simulation, cette méthode expérimentale peut être transférée directement aux configurations expérimentales plus sophistiquées. Par exemple, la simulation de système insert membrane peut être facilement transférée à la géométrie d’un 2-OC ou à d’autres systèmes avec des configurations similaires. Cette option de modulation de la simulation peut servir à appuyer la conception de futures expériences. En outre, les effets secondaires tels que l’évaporation, diffusion anormale et effets membranaires peut être intégrés pour améliorer la simulation, augmentant ainsi la précision. Le programme de simulation donne la possibilité de changer ou améliorer l’équation de simulation, ainsi que d’intégrer d’autres modules physiques afin d’enquêter sur d’autres aspects du développement de modèle de peau. Un exemple est la simulation de la production de la consommation et de lactate de glucose dans un modèle de cellules de collagène.

Un aspect particulièrement intéressant dans les essais de substances médicales est la façon dont les substances sont distribués dans un système d’orgue-on-a-chip. Le paramètre de simulation et de perméabilité mon aide pour répondre à des questions telles que comment rapidement une substance pénètre dans le système et dont la concentration sera disponible pour les autres tissus dans une puce multi-organes. Cette méthode peut appuyer et d’améliorer le développement et le test de tels systèmes d’organe-on-chip.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été créé avec le soutien financier de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Grant No. PO413/12-1 et LA 1028/7-1.

Materials

Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen  Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS  Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA
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Hsu, H., Kracht, J., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).
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