Ensayo de Fagocitosis para Células Apoptóticas en<em> Drosophila</em> Embriones

En animales metazoarios, por ejemplo el nematodo Caenorhabditis elegans , la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , y ratones y humanos, un gran número de células sufren apoptosis durante el desarrollo para modelar sus cuerpos y en la edad adulta para mantener la homeostasis ^{1 , 2} . Las células apoptóticas necesitan ser eliminadas rápidamente porque inducen inflamación en los tejidos circundantes liberando materiales intracelulares inmunogénicos si no se eliminan por completo ³ . Para facilitar la remoción rápida, las células apoptóticas presentan las denominadas señales de comer-me que son reconocidas por los receptores de engulfment de los fagocitos, y son eliminadas por fagocitosis ^{3 , 4 , 5 , 6} . Así, la fagocitosis desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del huésped, y por lo tanto, elucidar la molécula Los mecanismos subyacentes a la fagocitosis de las células apoptóticas son importantes.

Los mecanismos responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas parecen ser evolutivamente conservadas entre las especies en los nematodos, moscas y ratones [ ^7] . Actualmente se dispone de varios ensayos de fagocitosis para evaluar la absorción de células apoptóticas en estos animales modelo. En C. elegans , 131 células somáticas sufren muerte celular programada durante el desarrollo, y los cadáveres de células son phagocytosed por las células vecinas, que son no fagocitos profesionales [ ^8] . Por lo tanto, contar el número de cadáveres de células restantes en C. elegans indica el nivel de fagocitosis in vivo . En la búsqueda de mutantes de nematodos que muestran un mayor número de células muertas, varios genes necesarios para la fagocitosis han sido identificados y caracterizados genéticamente ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Los ensayos de fagocitosis ex vivo con fagocitos de cultivo primario, generalmente macrófagos, se usan a menudo en ratones. Las células apoptóticas se preparan usando líneas celulares tales como células Jurkat, y se mezclan con fagocitos primarios. Después de una incubación durante varias horas, se cuenta el número total de fagocitos y de fagocitos engullantes para evaluar el nivel de fagocitosis. Como una modificación sofisticada de este método, el grupo de Nagata desarrolló un ensayo de fagocitosis ex vivo con células que expresan un ICAD resistente a caspasa (inhibidor de la DNasa activada por caspasa), en el que las células apoptóticas no sufren fragmentación apoptótica del ADN, Las células son fagocitadas. Cuando estas células se usan como dianas apoptóticas en un ensayo de fagocitosis, sólo el ADN de las células apoptóticas engullidas está fragmentado y teñido por marcado de extremos dUTP mediados por TdT (TUNEL). Por lo tanto, el leveL de la absorción de células apoptóticas se mide por el recuento de señales TUNEL en una mezcla de fagocitos y células apoptóticas [ ^13] .

En D. melanogaster , los fagocitos profesionales denominados hemocitos, los macrófagos de Drosophila , son responsables de la fagocitosis de las células apoptóticas ^{14 , 15} . Además de los ensayos de fagocitosis in vitro con líneas celulares de cultivo, se dispone de ensayos de fagocitosis in vivo con embriones enteros de Drosophila . Los embriones de Drosophila son una poderosa herramienta para examinar el nivel de engrosamiento de células apoptóticas debido a que muchas células sufren apoptosis y son fagocitadas por hemocitos durante el desarrollo embrionario ^{14 , 15 , 16} . Un ejemplo de un ensayo de fagocitosis in vivo es el método desarrollado por el grupo de Franc. En su método, los hemocitos sonProtegido por la inmunotinción de peroxidasina, un marcador de hemocito, las células apoptóticas se tiñen utilizando el tinte nuclear, 7-amino actinomicina D en embriones enteros de Drosophila , y el número de células positivas dobles se cuenta como una señal de fagocitosis ¹⁷ . Otro ejemplo de un ensayo de fagocitosis en embriones se basa en el concepto de método de Nagata descrito anteriormente; Sin embargo, la fagocitosis in vivo se evalúa utilizando los embriones de dCAD ( Drosophila caspasa-DNasa activada) moscas mutantes [ ^{18 , 19]} . Estos ensayos de fagocitosis in vivo son útiles para observar directamente la fagocitosis in situ . Sin embargo, las dificultades están asociadas con la exclusión de cualquier sesgo posible en el paso de contar células fagocitosas porque es difícil observar todos los fagocitos y células apoptóticas en embriones enteros debido a su grosor.

Para superar esta limitación, desarrollamosUn nuevo ensayo de fagocitosis en embriones de Drosophila . En nuestro método, para poder contar fácilmente los hemocitos fagocitados, se homogeneizan embriones enteros para preparar células embrionarias dispersas. Los fagocitos son detectados por la inmunotinción de un marcador de fagocitos, y las células apoptóticas son detectadas por TUNEL con estas células embrionarias dispersas. El uso de células embrionarias dispersas nos permite medir los niveles de fagocitosis in vivo como si se realizara un ensayo de fagocitosis in vitro que cuantificara con precisión el nivel de fagocitosis. Todos los genotipos de moscas pueden emplearse en este ensayo si se desarrollan hasta la etapa 16 de los embriones ²⁰ , la etapa de desarrollo en la que la depuración de las células apoptóticas por fagocitosis es la más abundante. Este método tiene la ventaja de evaluar cuantitativamente el nivel de fagocitosis y, por tanto, puede contribuir a la identificación de nuevas moléculas implicadas en la fagocitosis de células apoptóticas in vivo .