アポトーシス細胞の食作用アッセイ<em>ショウジョウバエ</em>胚
Summary
本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。
Abstract
アポトーシス細胞の食作用の根底にある分子メカニズムは、免疫および炎症性難治性疾患におけるその役割のために、より詳細に解明される必要がある。本発明者らは、本明細書において 、エンザイムリアクションを制御する遺伝子ネットワークが哺乳動物から進化的に保存されているショウジョウバエを用いて、貪食を定量的に調べる実験的方法を開発した。全動物を用いて貪食細胞および貪食細胞を正確に検出および計数するために、 ショウジョウバエ胚をホモジナイズして、貪食細胞およびアポトーシス細胞を含む分散細胞を得た。分散胚細胞の使用は、我々は全体の胚では、すべての食細胞およびアポトーシス細胞を観察し、正確に食作用のレベルを定量化することも可能であるインビトロ食作用アッセイを行ったかのようにin vivoでの食作用のレベルを測定することが可能になります。この方法が以前の研究のものを再現することを確認したアポトーシス細胞の貪食に必要な遺伝子を同定した。この方法は、死細胞の貪食を分析することができ、 ショウジョウバエの強力な遺伝学と組み合わせると、貪食細胞によるアポトーシス細胞の遊走、認識、貪食、分解からなる複合貪食反応を明らかにする。
Introduction
後生動物では、 例えば 、線虫線虫（Caenorhabditis elegans）、果実はキイロショウジョウバエ 、マウスやヒトを飛ぶ、細胞の大多数は、自分の体を形作るために開発中のアポトーシスを受けるし、成人期に恒常性1、2を維持します。アポトーシス細胞は、完全に除去されなければ免疫原性細胞内物質を放出することによって周囲の組織に炎症を誘発するため、迅速に除去する必要がある3 。食細胞の貪食受容体によって認識され、貪食3、4、5、6によって除去される迅速な除去を容易にするために、本アポトーシス細胞いわゆる食べる-MEを信号。このように、食作用は宿主恒常性の維持に重要な役割を果たし、従って、分子の解明アポトーシス細胞の食作用の根底にある機構が重要である。
アポトーシス細胞の食作用に関与する機構は、線虫、ハエ、およびマウスの種間で進化的に保存されているようである7 。いくつかの食作用アッセイが、現在、これらのモデル動物におけるアポトーシス細胞の貪食を評価するために利用可能である。 線虫では 、131体細胞は発達中にプログラム細胞死を起こし、細胞死体は非専門食細胞である隣接細胞によって貪食される8 。したがって、 C.エレガンスの残りの細胞死体の数を数えることは、インビボでの食作用のレベルを示す。死細胞数の増加を示し、線虫の変異体を探索することにより、食作用のために必要ないくつかの遺伝子が同定されており、遺伝的に10、9特徴付け、S = "外部参照"> 11、12。
初代培養食細胞、一般にマクロファージを用いたエクスビボ食作用アッセイは、しばしばマウスにおいて利用される。アポトーシス細胞は、Jurkat細胞のような細胞系を用いて調製され、一次貪食細胞と混合される。数時間のインキュベーションの後、ファゴサイトーシスのレベルを評価するために、ファゴサイトおよび貪食ファゴサイトの総数を数える。この方法の洗練された改変として、Nagataのグループは、アポトーシス細胞がアポトーシスDNA断片化を起こさないカスパーゼ耐性ICAD（カスパーゼ活性化DNアーゼ阻害剤）を発現する細胞を用いたex vivo食作用アッセイを開発したが、細胞は貪食される。これらの細胞を食作用アッセイにおいてアポトーシス標的として使用する場合、貪食されたアポトーシス細胞のDNAのみが断片化され、TdT媒介dUTPニック末端標識（TUNEL）によって染色される。したがって、アポトーシス細胞の貪食は、食細胞とアポトーシス細胞の混合物中のTUNELシグナルを計数することによって測定される13 。
キイロショウジョウバエでは、血球、 ショウジョウバエマクロファージ、名前のプロの食細胞がアポトーシスを起こした細胞14、15の食作用を担当しています。培養細胞系を用いたin vitro食作用アッセイに加えて、 ショウジョウバエの全胚を用いたin vivo食作用アッセイが利用可能である。 ショウジョウバエの胚は、多くの細胞がアポトーシスを受けるし、胚発生14、15、16の間に血球によって貪食されているので、アポトーシス細胞の貪食のレベルを調べるための強力なツールです。 インビボ貪食アッセイの一例は、フランのグループによって開発された方法である。彼らの方法では、血球は、ペルオキシダの免疫染色、血球マーカーによってtected、アポトーシス細胞を核染料を用いて染色し、7-アミノアクチノマイシンD全体ショウジョウバエ胚において、二重陽性細胞の数は、貪食17の信号としてカウントされます。胚に対する食作用アッセイの別の例は、上記の永田の方法の概念に基づいている。しかしながら、 インビボで食作用は、（ ショウジョウバエカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ）突然変異体は18、19ハエDCADの胚を用いて評価されます。これらのインビボ食作用アッセイは、インサイチューで食作用を直接観察するのに有用である。しかしながら、貪食細胞の計数段階において可能な偏りを除外することには困難が伴う。なぜなら、その厚さのために全胚細胞中の全ての食細胞およびアポトーシス細胞を観察することが困難であるからである。
この制限を克服するために、我々はショウジョウバエの胚における新しい食作用アッセイを編集した。我々の方法では、貪食細胞を容易に計数するために、全胚を均質化して分散胚細胞を調製する。貪食細胞は食細胞マーカーの免疫染色により検出され、アポトーシス細胞はこれらの分散した胚細胞を有するTUNELによって検出される。分散された胚細胞の使用は、私たちが食作用のレベルを正確に定量するインビトロ貪食アッセイを行ったかのようにインビボ貪食レベルを測定することを可能にする。食作用によるアポトーシス細胞クリアランスが最も豊富な発生段階である、胚20の段階16に発展する場合、このアッセイでは、全ての遺伝子型のハエを用いることができる。この方法は、食作用のレベルを定量的に評価する利点を有し、したがって、 インビボでのアポトーシス細胞の食作用に関与する新しい分子の同定に寄与し得る 。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書では、 ショウジョウバエ胚を用いた食作用アッセイについて記載した。胚細胞を分散させて貪食量を定量的に測定することにより、血球マーカーであるCroquemortまたはsrpHemo-駆動GFPについて、血球、 ショウジョウバエプロフェッショナル貪食細胞を免疫染色し、アポトーシス細胞をこのプロトコールでTUNELによって検出する。食作用のレベルは、血球の総数お…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはKaz NagaosaとShiratsuchi Akikoに助言をしてくれたことに感謝します。
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
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