Apoptotik Hücreler İçin Fagositoz Testi<em> Drosophila</emEmbriyolar
Summary
Drosophila'nın dağıtılmış embriyonik hücrelerini kullanarak bir fagositoz tahlili burada tarif edilmektedir. Bu, in vivo fagositoz seviyelerini kolay ve kesin bir şekilde ölçmemize ve apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli olan yeni molekülleri belirlememize olanak tanır.
Abstract
Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan moleküler mekanizmalar, bağışıklık ve inflamatuar dirençli hastalıklarda rolünden dolayı daha ayrıntılı olarak açıklığa kavuşturulmalıdır. Burada, fide soğurumunu kontrol eden gen şebekesinin memelilerden evrimsel olarak korunduğu Drosophila meyve sineği kullanılarak kantitatif olarak fagositozu araştırmak için deneysel bir yöntem geliştirdik. Tam hayvanlar kullanılarak engulfing ve un-engulfing fagositleri doğru tespit etmek ve saymak için Drosophila embriyoları, fagositler ve apoptotik hücreler de dahil olmak üzere dağılmış hücreler elde etmek üzere homojenize edildi. Dağıtılmış embriyonik hücrelerin kullanımı, in vitro fagositoz düzeylerini, bütün embriyolardaki tüm fagositleri ve apoptotik hücreleri gözlemlemek ve fagositoz düzeyini tam olarak ölçmek mümkün olan bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçebilir. Bu yöntemin daha önceki çalışmaların yöntemlerini ürettiğini doğruladıkBu, apoptotik hücrelerin fagositozu için gerekli genleri belirledi. Bu yöntem, ölü hücrelerin parçalanmasını sağlar ve Drosophila'nın güçlü genetiği ile birleştirildiğinde, fagositler tarafından apoptotik hücrelerin migrasyonu, tanınması, yutulması ve parçalanması ile oluşan karmaşık fagositik reaksiyonları ortaya çıkaracaktır.
Introduction
Metazoan hayvanlarda, örneğin nematod Caenorhabditis elegans , meyve sinek Drosophila melanogaster ve fare ve insanlar, çok sayıda hücre vücutlarını şekillendirmek için gelişme döneminde ve erişkinlikte homeostazı 1 , 2 korumak için apoptoz geçirir. Apoptotik hücrelerin hızla çıkartılması gerekir çünkü bunlar, tamamen çıkarılmasa bile, immünojenik hücre içi materyalleri serbest bırakarak çevreleyen dokularda iltihap oluştururlar 3 . Hızlı kaldırmayı kolaylaştırmak için, apoptotik hücreler, fagositlerin yutulma reseptörleri tarafından tanınan ve yememe sinyalleri olarak adlandırılırlar ve fagositoz 3 , 4 , 5 , 6 ile ortadan kaldırılırlar. Böylece, fagositoz ana homeostazın korunmasında hayati bir rol oynar ve bu nedenle molekülün aydınlatılması Apoptotik hücrelerin fagositozunun altında yatan mekanizmalar önemlidir.
Apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumlu mekanizmalar, nematodlar, sinekler ve farelerdeki türler arasında evrimsel olarak korunmuş gibi gözükmektedir 7 . Bu model hayvanların apoptotik hücrelerin soğumasını değerlendirmek için çeşitli fagositoz testleri mevcuttur. C. elegans içinde, 131 somatik hücre gelişimi sırasında programlanmış hücre ölümü ve hücre cesetleri profesyonel olmayan fagositler 8 olan komşu hücreler tarafından fagosite edilen. Böylece, C. elegans'taki kalan hücre cesetlerinin sayısının sayılması, in vivo fagositoz seviyesini gösterir. Ölü hücrelerin artan sayısını gösteren nematod mutantlarını araştırarak, fagositoz için gereken birkaç gen tespit edildi ve genetik olarak 9 , 10 ,S = "xref"> 11 , 12 .
Birincil kültür fagositleri (genellikle makrofajlar) ile ex vivo fagositoz testleri, farelerde sıklıkla kullanılır. Apoptotik hücreler, Jurkat hücreleri gibi hücre hatları kullanılarak hazırlanır ve primer fagositlerle karıştırılır. Birkaç saat inkübasyondan sonra fagositoz seviyesini değerlendirmek için toplam fagosit sayısı ve sindirim fagosit sayısı hesaplanır. Bu yöntemin sofistike bir modifikasyonu olan Nagata'nın grubu, apoptotik hücrelerin apoptotik DNA fragmantasyonuna maruz kalmadığı, ancak kaspaza dirençli bir ICAD (kaspazla aktive DNaz inhibitörü) eksprese eden hücrelerle ex vivo fagositoz testi geliştirdi; ancak DNA hala kesildiğinde Hücreler fagositozlanır. Bu hücreler, bir fagositoz tahlilinde apoptotik hedefler olarak kullanıldığında, sadece sarmalanmış apoptotik hücrelerin DNA'sı parçalanır ve TdT aracılı dUTP nick uç etiketlemesi (TUNEL) ile boyanır. Bu nedenle, leveL apoptotik hücre yutulması, bir fagosit ve apoptotik hücre karışımı 13 içinde TUNEL sinyallerinin sayılmasıyla ölçülür.
D. melanogaster'da , hemocytes adında profesyonel fagositler, Drosophila makrofajları, 14 , 15 apoptotik hücrelerin fagositozundan sorumludur. Kültür hücresi soyları ile yapılan in vitro fagositoz analizlerine ek olarak , bütün Drosophila embriyolarıyla in vivo fagositoz analizleri mevcuttur. Drosophila embriyolar birçok hücreleri apoptozise uğrar ve embriyonik gelişim 14, 15, 16 boyunca hemocytes tarafından fagosite edilir çünkü apoptotik hücre yutulma seviyesinin incelenmesine yönelik güçlü bir araçtır. Bir in vivo fagositoz tahliline bir örnek, Franc'in grubu tarafından geliştirilen yöntemdir. Yöntemlerinde hemositler deBir hemosit işareti olan peroksidazenin immüno-lekelemesi ile tespit edilen apoptotik hücreler, bütün Drosophila embriyolarında 7-amino aktinomisin D nükleer boya kullanılarak lekelenmiş ve çift pozitif hücrelerin sayısı, fagositoz 17 sinyali olarak sayılmıştır. Embriyolarda bir fagositoz tahlili için bir başka örnek, yukarıda tarif edilen Nagata metodu kavramına dayanır; Bununla birlikte, in vivo fagositoz, dCAD ( Drosophila caspase-activated DNase) mutant sinekler 18 , 19'un embriyoları kullanılarak değerlendirilir. Bu in vivo fagositoz testleri doğrudan in situ fagositoz gözlemlemek için yararlıdır. Bununla birlikte, zorluklar, fagosit hücrelerini sayma aşamasındaki muhtemel yanlılıkların hariç tutulması ile ilişkilidir; çünkü kalınlığından ötürü bütün embriyoların tüm fagositlerini ve apoptotik hücrelerini gözlemlemek zordur.
Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için,Drosophila embriyolarında yeni bir fagositoz testi yaptı. Yöntemimizde, fagositozan hemositleri kolayca sayabilmek için, bütün embriyolar dağınık embriyonik hücreleri hazırlamak için homojenize edilir. Fagositler, bir fagosit markörünün immün boyaması ile tespit edilir ve apoptotik hücreler, bu dağınık embriyonik hücreler ile TUNEL tarafından saptanır. Dağıtılan embriyonik hücrelerin kullanılması, in vivo fagositoz düzeylerini, fagositoz düzeyini tam olarak ölçen bir in vitro fagositoz tahlilini gerçekleştirmiş gibi ölçmenizi sağlar. Bunlar embriyo 20 16 fagositozla olan apoptotik hücre mesafesi en bol gelişimsel aşama aşama için gelişirse sinekler tüm genotipler Bu deneyde kullanılabilir. Bu yöntem, fagositoz seviyesini kantitatif olarak değerlendirmenin avantajına sahiptir ve bu nedenle apoptotik hücrelerin in vivo fagositozunda yer alan yeni moleküllerin tanımlanmasına katkıda bulunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Drosophila embriyolarını kullanan bir fagositoz tahlili tarif ettik. Fagositozu niceliksel olarak ölçmek için dağınık embriyonik hücreler kullanarak Hemocytes, Drosophila professional phagocytes, Hemocyte marker Croquemort veya srpHemo- kaynaklı GFP için immünostained ve apoptotik hücreler bu protokolde TUNEL tarafından tespit edilir. Fagositoz seviyesi, hemositlerin ve fagosit oksitleyici hemositlerin toplam sayısını sayarak bir fagositik indeks olarak ifade edi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onların tavsiyeleri için Kaz Nagaosa ve Akiko Shiratsuchi'ye minnettarız.
Materials
| whole swine serum | MP Biomedicals | 55993 | For bloking |
| Treff micro test tube(easy fit) Dnase, Rnase free tube, 1.5 mL | TreffLab | 96. 4625. 9. 01 | For homogenization |
| pellet mixer 1.5 mL | TreffLab | 96. 7339. 9. 03 | For homogenization |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C-0130 | For preparation of embryonic cells |
| Trypsin | Thermo Fisher SCIENTIFIC | 27250-018 | For preparation of embryonic cells |
| Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP | KPL | 475-1612 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| 5-bromo-4-chloro- 3-indolyl-phosphate |
Roche | 11383221001 | BCIP, For staining of hemocytes |
| nitro blue tetrazolium | Roche | 11383213001 | NBT, For staining of hemocytes |
| Anti-Croquemort antibody | described previously in Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476 | ||
| Anti-GFP from mouse IgG1κ (clones 7.1 and 13.1) |
Roche | 11814460001 | For staining of hemocytes |
| Goat Anti-Mouse IgG-AP Conjugate | Bio-Rad | 170-6520 | secondary antibody for stainig hemocytes with an anti-Croquemort antibody |
| Apop Tag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | For staining of apoptoitc cells. This kit includes Equilibration buffer, Reaction buffer, STOP/Wash buffer, TdT enzyme, and Anti-Digoxigenin-Peroxidase. |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrichloride |
nacalai tesque | 11009-41 | DAB, For staining of apoptoitc cells |
| Table of Fly Strains | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w1118 | Control flies, described in Freeman et al., Neuron, 38, 567-580 | ||
| drprΔ5 | drpr mutant, described in Freeman et al, Neuron, 38, 567-580 | ||
| Itgbn2 | Itgbn mutant, described in Devenport et al., Development, 131, 5405-5415 | ||
| srpHemoGAL4 UAS-EGFP | described in Brückner et al., Dev. Cell., 7, 73-84 | ||
| UAS-drpr-IR | VDRC | 4833 | – |
| UAS-Itgbn-IR | NIG-fly | 1762R-1 | – |
References
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116 (2), 205-219 (2004).
- Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. Cell death in development. Cell. 96 (2), 245-254 (1999).
- Savill, J., Fadok, V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).
- Ravichandran, K. S., Lorenz, U. Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal. Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).
- Ravichandran, K. S. Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways. Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).
- Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis. Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).
- Reddien, P. W., Horvitz, H. R. The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).
- Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).
- Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans. Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).
- Gumienny, T. L. CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration. Cell. 107 (1), 27-41 (2001).
- Hsu, T. Y., Wu, Y. C. Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling. Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).
- Hanayama, R. Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes. Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).
- Gold, K. S., Bruckner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).
- Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117 (1), 29-43 (1993).
- Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).
- Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation. Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).
- Manaka, J. Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages. J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).
- Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 3868-3878 (1998).
- Kuraishi, T., et al. Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells. Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).
- Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells. Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).
- Kuraishi, T. Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila. Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).
- Nagaosa, K. Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos. J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).
- Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila. J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).
- Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila. Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).
- Bruckner, K., et al. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Nonaka, S., et al. Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells. J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).
- Hanayama, R. Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice. Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).
