Анализ фагоцитоза для апоптозных клеток в<em> Drosophila</em> Эмбрионы

В метазоановых животных, например, нематод Caenorhabditis elegans , фруктовая муха Drosophila melanogaster и мыши и люди, большое количество клеток подвергается апоптозу во время развития, чтобы сформировать свои тела и в зрелом возрасте поддерживать гомеостаз ^{1 , 2} . Апоптотические клетки необходимо быстро удалить, потому что они индуцируют воспаление в окружающих тканях путем высвобождения иммуногенных внутриклеточных материалов, если они не полностью удалены ³ . Чтобы облегчить быстрое удаление, апоптотические клетки представляют собой так называемые сигналы питания, которые распознаются поглощающими рецепторами фагоцитов и устраняются фагоцитозом ^{3 , 4 , 5 , 6} . Таким образом, фагоцитоз играет решающую роль в поддержании гомеостаза хозяина и, следовательно, выясняет молекулу Важные механизмы, лежащие в основе фагоцитоза апоптозных клеток, имеют важное значение.

Механизмы, ответственные за фагоцитоз апоптотических клеток, по-видимому, эволюционно сохраняются среди видов у нематод, мух и мышей ⁷ . В настоящее время доступно несколько анализов фагоцитоза для оценки охвата апоптотических клеток у этих модельных животных. У C. elegans 131 соматические клетки подвергаются запрограммированной гибели клеток во время развития, а трупы клеток фагоцитируются соседними клетками, которые являются непрофессиональными фагоцитами ⁸ . Таким образом, подсчет количества оставшихся трупы клеток у C. elegans указывает на уровень фагоцитоза in vivo . Путем поиска мутантов нематод, которые показывают увеличенное количество мертвых клеток, было идентифицировано несколько генов, необходимых для фагоцитоза, и генетически характеризуются ^{9 , 10 ,}S = "xref"> 11 ^{, 12} .

Экс- фагоцитоз ex vivo с фагоцитами первичной культуры, обычно макрофагами, часто используют у мышей. Апоптотические клетки получают с использованием клеточных линий, таких как клетки Jurkat, и смешивают с первичными фагоцитами. После инкубации в течение нескольких часов подсчитывают общее количество фагоцитов и поглощающих фагоцитов для оценки уровня фагоцитоза. В качестве сложной модификации этого метода группа Nagata разработала анализ фагоцитоза ex vivo с клетками, экспрессирующими резистентный к каспазе ICAD (ингибитор активированной каспазой ДНКазы), в которой апоптотические клетки не подвергаются апоптотической фрагментации ДНК, но ДНК все еще расщепляется, когда Клетки фагоцитированы. Когда эти клетки используются в качестве апоптотических мишеней в анализе фагоцитоза, только ДНК поглощенных апоптотических клеток фрагментируется и окрашивается опосредованной TdT опорой концевого звена dUTP (TUNEL). Следовательно,L популяции апоптотических клеток измеряется путем подсчета сигналов TUNEL в смеси фагоцитов и апоптотических клеток ¹³ .

В D. melanogaster профессиональные фагоциты, названные гемоцитами, макрофагами Drosophila , ответственны за фагоцитоз апоптотических клеток ^{14 , 15} . В дополнение к анализу фагоцитоза in vitro с клеточными линиями клеток доступны анализы фагоцитоза in vivo с целыми эмбрионами дрозофилы . Зародыши дрозофилы являются мощным инструментом для изучения уровня апоптотического захвата клеток, поскольку многие клетки подвергаются апоптозу и фагоцитируются гемоцитами во время эмбрионального развития ^{14 , 15 , 16} . Примером анализа фагоцитоза in vivo является метод, разработанный группой Франка. В их методе гемоциты являютсяПри помощи иммуноокрашивания пероксидазина маркер гемоцитов апоптотические клетки окрашиваются с использованием ядерного красителя, 7-амино актиномицина D у всех эмбрионов дрозофилы , а число двойных положительных клеток считается сигналом фагоцитоза ¹⁷ . Другой пример анализа фагоцитоза на эмбрионах основан на концепции описанного выше метода Нагаты; Однако фагоцитоз in vivo оценивается с использованием эмбрионов мутантов dCAD ( дрозофила каспазы-активированной ДНКазы) ^{18 , 19} . Эти анализы фагоцитоза in vivo полезны для непосредственного наблюдения фагоцитоза in situ . Однако трудности связаны с исключением любого возможного смещения на этапе подсчета фагоцитозирующих клеток, потому что из-за его толщины трудно наблюдать все фагоциты и апоптотические клетки у всех эмбрионов.

Чтобы преодолеть это ограничение, мы развиваемсяОпубликовал новый анализ фагоцитоза у эмбрионов дрозофилы . В нашем методе, чтобы легко подсчитать фагоцитозирующие гемоциты, целые эмбрионы гомогенизируют для получения дисперсных эмбриональных клеток. Фагоциты обнаруживают путем иммуноокрашивания маркера фагоцитов, а апоптотические клетки обнаруживают TUNEL с этими диспергированными эмбриональными клетками. Использование дисперсных эмбриональных клеток позволяет измерять уровни фагоцитоза in vivo, как если бы мы провели анализ фагоцитоза in vitro, который точно определяет уровень фагоцитоза. Все генотипы мух могут быть использованы в этом анализе, если они развиваются до стадии 16 эмбрионов ²⁰ , стадии развития, при которой апоптотический клиренс клеток фагоцитозом является наиболее распространенным. Этот метод имеет то преимущество, что количественно оценивает уровень фагоцитоза и, таким образом, может способствовать идентификации новых молекул, участвующих в фагоцитозе апоптотических клеток in vivo .