Bu yayın entegre elektrotlar transendothelial elektrik direniş (AYLARININ) doğrudan miktar için bir organ-on-chip cihazı imalatı açıklar. Doğrulama, kan – beyin bariyerini bu mikrosıvısal cihazın içinde taklit ve bariyer fonksiyonu izlenir. Elektrot entegrasyon ve doğrudan AYLARININ miktar için sunulan yöntemleri genel olarak geçerlidir.
Organlar üzerinde fiş, vitro modelleri, içinde mikrosıvısal aygıtları (insan) doku kültürü ile ilgili çoğu hızla gelişmekte olan yararlı sağlamak için söz araştırma ve insan sağlığı ve hastalığı çalışmak için araçlar. Organ-on-chip cihazlar içinde kültürlü hücre katmanları bariyer fonksiyonu ayırdetmek için genellikle transendothelial ya da transepithelial elektrik direnci (AYLARININ) ölçülür. Bu amaçla, elektrotlar genellikle yonga elektrotlar alıcılar çipin içine el ile ekleme ile elde daha daha istikrarlı ölçümler sağlamak için mikro işleme yöntemleri tarafından entegre edilmiştir. Ancak, bu elektrotlar sık okudu hücre tabakasının görsel denetim engel veya imalat için pahalı temiz oda işlemlerinin izlenmesini gerektirir. Bu sınırlamalarını aşmak için burada açıklanan cihaz yer alan ve görsel denetim sağlayarak kültür alanı dışında sabit dört kolayca entegre elektrotlar içerir. Altı ölçüm yolları dayanıklılığını sayılabilir, bu dört elektrotlar hangi AYLARININ doğrudan, bağımsız kültür orta dolu mikro direnç olarak izole kullanarak. Kan – beyin bariyerini bu cihazda çoğaltılan ve onun AYLARININ aygıt uygulanabilirliği göstermek için izlenir. Bu çip, entegre elektrotlar ve AYLARININ belirleme yöntemini genellikle organları-Tarih-fiş diğer organlara taklit veya mevcut organ-on-chip sistemleri içine dahil olmak için geçerlidir.
Organları fiş hızla yeni bir ortaya çıkan ve sınıf in vitro doku modelleri umut verici. 1 bu modelleri, bu hücrelerin fizyolojik microenvironment taklit ediyorlar şekilde tasarlanmıştır mikrosıvısal cihazlar içinde hücreler kültürlü. 1 , 2 bu basit tasarım ve temel fonksiyonu geleneksel vitro modellerden beklenenden daha gerçekçi fizyolojik veya patolojik davranış bu hücrelerin içinde sonuçlanır. 3 , 5 , 6 Ayrıca, organları fiş içinde vivo modellere kıyasla bir daha iyi kontrol edilebilir ortamı sağlamak ve insan kaynaklı sadakatle insan fizyolojisi ve patoloji çoğaltmak için sağlıklı ve hastalıklı doku dahil edebilirsiniz. Kan – beyin engelleri gelişimi son zamanlarda özetlenen gelişmeler yongaları (BBBs-Tarih-çipleri) üzerinde alan ileri hızlı hareketli olduğunu göster. 7
Onlar gerçek zamanlı ve sürekli mikroskobu, on-line biyokimyasal analizler ve entegre sensörler tarafından cihazın içinde kültürlü dokusu izlemeyi etkinleştir organları fiş başka bir avantaj sağlıyor. 1 , 2 Örneğin, transendothelial veya transepithelial elektriksel direnç (AYLARININ) ölçme non-invaziv geliştirme izlemek için güçlü bir yöntem olduğunu ve bozulma bariyer oluşturan dokular. 8 , 9 , 10 AYLARININ elektriksel direnç hücresel bir engeldir ve bu nedenle bariyer bütünlüğünü ve geçirgen göstergesidir. 10 organları-Tarih-fiş, hücresel engelleri genel olarak iki akışkan kanalları, apikal temsil eden ve bu bariyer doku demiri bölmeleri ayıran bir membran üzerinde kültürlü. Böyle cips AYLARININ ölçümleri uygun giriş ve çıkışları iki kanalının takılı elektrotları ile yapılabilir. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ancak, el ile ekleme ve elektrot reinsertion kolayca yerleştirme hataları ve böylece örneğin olarak ölçülen direnç değişimler mikro ile daha uzun veya daha kısa yolları dayanıklılığını farklılıkları neden olabilir önemli hücre bariyer direnç karşılaştırılır. 16 cihazlar entegre elektrotlar ile reinsertion hataları ortadan kaldırmak için önerilmiştir. Ancak, bu tümleşik elektrotlar çoğunu doku kültürü17,18,19,20,21 teftiş zaman görmenize ve/veya gerektiren özel temiz oda imalat için işler. 17 , 22
Bu yayındaki bir önceki yayında,16 uygulanan ilk organ-on-chip cihaz görünürlüğü ölçülen hücre katmanı ve kolay üretim on tümleşik elektrotlar kararlılığını birleştirir. Tasarım ve üretim bu çip şekil 1‘ de tasvir. Kısacası, bu cihaz iki polydimethylsiloxane (PDMS) bölümden oluşur birlikte bağlı kanal diziniz ile kaçak içermeyen bir polikarbonat membran ile 0,4 ile µm arasında gözenekleri. Dört Platin tel elektrotlar takılı ve yerine bir photocurable ile sabit kültür alanı dışında iyi yapıştırıcı. Tüm bu üretim adımları genel Laboratuar donanımları, ezelî belgili tanımlık lüzum için a temiz oda çevre ile yapılabilir. Bunun üzerine, altı empedans ölçümleri yapılabilir böylece ölçülen AYLARININ doğrudan izolasyon kesit için çıkılan ve böylece etkisi en aza indirilmesi mikro direnç bağımsız izin bu dört elektrotlar kullanarak biyolojik olmayan çeşitleri sistemindeki (yeniden) ekleme hataları gibi. 16
Bu aygıt ve doğrudan AYLARININ ölçümleri uygulanabilirliği göstermek için kan – beyin bariyerini (BBB) bu yongası çoğaltılan. Bu biyolojik bariyer özel endotel hücreleri oluşur ve kan ve beyin beyin homeostazı sağlayacak arasında ulaşım düzenler. 23 , 24 BBB taklit etmek için mikrosıvısal cihazın üst kanal (lütfen Dr. s.-O. tarafından sağlanan hCMEC/D3 hücre kültürünü insan beyin mikrovasküler endotel hücreleri ile kaplı Couraud, INSERM, Paris, Fransa). 25 sunulan yöntem, ancak, daha genel olarak herhangi bir organ-on-chip cihaz iki bölmeleri ile uygulanabilir, doğrudan AYLARININ belirlenmesi kolayca kullanma etkinleştirme elektrotlar entegre.
Bu makale, ilk organ-on-chip cihazın entegre elektrotlar ile imalat işlemi açıklanmıştır. İleri, tohumlama yordam ve cihazın içinde beyin endotel hücrelerinin kültürü olduğunu açıkladı, üstünde-küçük parça AYLARININ ölçümleri yanı sıra. Sonuçlar bölümünde temsilcisi AYLARININ ölçümleri gösterilir ve veri işleme açıklığa kavuşturuldu. Son olarak, sunulan cihaz ve AYLARININ izlenecek yöntem uygulanabilirliği gösterilen BBB-tarih-3 gün boyunca takip çipi, bariyer fonksiyonu sunulur.
Bu makale, bir organ-on-chip aygıt mühendislik ve cihazda kültürlü bir hücresel bariyer transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) doğrudan belirlenmesi sunuldu. Elektrotlar temiz oda ekipmanları ve dört elektrot kullanarak doğrudan AYLARININ belirlenmesi olmadan entegre sunulan yöntemi iki mikrosıvısal bölmeleri ile herhangi bir organ-on-chip aygıt için geçerlidir. Dört elektrotlar iki bölmeleri ayrılır sürece geometri ve çip düzeni öngörülen deneyler gereksinimlerine uyacak şekilde adapte edilebilir. Altı ölçümleri süresince yerinde fiksasyonlu koşuluyla dört elektrotlar bile varolan fişleri, alıcılar içinde uygun eklenebilir. Kaçak-Alerjik yapıştırma yöntemi farklı membranlar ve kanal geometrileri için PDMS/toluen oranını değiştirerek getirilebilir. Daha yüksek bir toluen içerik bir ince spin kaplı katmanda harç26 sonuç ve sığ ve dar Kanallar PDMS yerlerinde için daha uygun olabilir. Bir alt toluen içerik sonuçlarında daha kalın bir havan topu26 katman ve PDMS bölümleri arasında kalın membranların aldığınızdan daha uygun olabilir.
Şekil 2A şematik empedans spectra ve şekil 2E ve 2Fdeneysel spectra görüldüğü gibi empedans ölçümleri çift katmanlı kapasite elektrot-orta arayüz tarafından etkilenmektedir. Elektrotlar mikro içinde küçük boyutu nedeniyle, çift katmanlı kapasite empedans spectra, AYLARININ miktar zorlaştıran hücresel bariyer rezistif Yaylası üzerinden hâkim olunamaz. Bu sorunu gidermek için elektrotlar takılı fiksasyon önce kültür kanalları içine daha fazla. Bu maruz elektrot yüzey alanını artırır kültür ortamına ve bununla çift katmanlı kapasite de artacak. Böylece hücresel bariyer rezistif Yaylası daha kolay tanınan ve quantified olabilir bu düşük frekanslar için kapasitif yamaç bir kayma olur. Her ne kadar iki elektrot arasında ölçülen yol direnci daha küçük olacak, bu tabi sunulan yöntem AYLARININ miktar etkiler değil.
Hücresel bariyeri ölçme sırasında ekstra rezistif Yaylası tanınamıyor mümkündür. Bu membran kötü harç tarafından ölçülen bir yol etrafında hücresel bariyer yol alınmış Örneğin iki kanal arasında sıvı bir bağlantı sonucu olabilir. Buna ek olarak, olabilir dışında çip elektrotlar kültür orta bir damlacık tarafından bağlıysanız, elektrik köprü oluşturma. Bu genellikle daha düşük ölçülen empedansı ile kombine ve bu köprü kültür ortamının kaldırarak çözülebilir. Son olarak, orada hiçbir direnç Yaylası ve ölçülen empedans büyüklük beklenenden daha yüksek ise, gevşek bir bağlantı elektrik tesisatı veya güç kaynağı olabilir.
Gelecekte, geçerli BBB-on-chip fizyolojik alaka BBB farklılaşma ve artış bariyer gerginlik tanıtmak için bildirdi ve elde etmek zor stres fizyolojik düzeylerde yamultmak için endotel hücreleri açarak artırılabilir geleneksel vitro modellerinde. 29 Ayrıca, beyin kaynaklı hücreler endotel ile birlikte kültürlü için uygun bir bölme sunulan cihazın alt kanal sağlar. Bu da bariyer fonksiyonu artması beklenmektedir ve ayrıca patolojik şartlar altında ilgili hücre tipleri arasındaki karmaşık etkileşimler çalışma sağlar. 29
Sonuç olarak, bu yayında açıklanan organ-on-chip cihaz standart laboratuvar donanımları kullanarak sahte olduğu ve görsel denetim okudu hücrenin engel değil dört entegre elektrotları kullanarak doğrudan AYLARININ ölçüleri sağlamak için gösterilen katman. Bu aygıt organları fiş alanındaki uygulanabilirliği bu çip BBB taklit ve kültür döneminde AYLARININ izleme gösterilmiştir. Diğer (bariyer) organlara bir dizi bu çipe diğer ilgili hücre tipleri dahil olmak üzere taklit. Buna ek olarak, cihaz ve sistemler arasında karşılaştırılabilir tekrarlanabilir ve anlamlı AYLARININ değerleri ulaşmak için diğer iki bölme tabanlı organ-on-chip cihazlarda AYLARININ ölçme yöntemi kolayca uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Minnetle Mathijs Bronkhorst ve kalıp imalatı verimli tartışmalar ve veri gösterimi ile yardım için Johan Bomer kabul.
Bu araştırma tarafından finanse edildi: SRO Biyomedikal Microdevices, L.I. Segerink, MIRA Enstitüsü Biyomedikal mühendislik ve teknik tıp, Twente Üniversitesi; SRO organları-Tarih-cips Milattan sonra van der Meer, MIRA Enstitüsü Biyomedikal mühendislik ve teknik tıp, Twente Üniversitesi; ve VESCEL, ERC gelişmiş hibe A. van den Berg (grant no. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |