这本出版物描述了一个 organ-on-chip 装置的制造与集成电极直接量化的 transendothelial 电阻 (TEER)。为验证, 在该微流控装置内模拟血脑屏障, 监测其屏障功能。所提出的电极集成方法和直接 TEER 定量是普遍适用的。
上,体外模型涉及微流控装置内 (人体) 组织的培养, 正在迅速涌现, 并有望为研究人类健康和疾病提供有用的研究工具。为了表征 organ-on-chip 装置内培养的细胞层的屏障功能, 通常 transendothelial 或 transepithelial 电阻 (TEER) 进行测量。为此, 电极通常集成到芯片的微加工方法, 以提供更稳定的测量比通过手工插入电极进入芯片的入口。然而, 这些电极经常妨碍对所研究的细胞层进行目视检查, 或需要昂贵的洁净室工艺进行制造。为了克服这些限制, 这里所描述的设备包含了四容易集成的电极, 它们被放置在文化区域之外并进行固定, 使目视检查成为可能。使用这四电极六测量路径的抵抗可以是定量的, TEER 可以直接地被隔绝, 独立抵抗文化中等填装的微。在该装置中复制了血脑屏障, 并对其 TEER 进行了监测, 以表明该装置的适用性。这个芯片, 集成电极和 TEER 测定方法一般适用于上, 既模仿其他器官或被纳入现有的 organ-on-chip 系统。
上是迅速涌现的新的和有为的类在体外组织模型。1在这些模型中, 细胞是在微流控设备中培养的, 它们的设计方法是模仿这些细胞的生理环境。1,2这将导致这些细胞的生理或病理行为比传统的体外模型的简单设计和基本功能更逼真。3,5,6此外, 上提供了比体内模型更好的可控环境, 并且可以将健康和病态的组织从人类起源中结合起来, 忠实地复制人类生理学和病理学。最近总结的发展的血脑屏障芯片 (BBBs-on-chips) 表明, 该领域是迅速向前迈进。7
上的另一个优点是, 通过显微镜、on-line 生化分析和集成传感器, 它们能够 real-time 和连续监测设备内培养的组织。1,2例如, 测量 transendothelial 或 transepithelial 电阻 (TEER) 是一种强有力的方法, 用于监测性障碍形成组织的发育和破坏。8,9,10 TEER 是跨细胞屏障的电阻, 因此表明了屏障的完整性和渗透性。10在上中, 细胞屏障通常在分离两个流体通道的膜上培养, 代表该屏障组织的顶端和侧隔间。在这种芯片中, TEER 测量可以方便地进行, 电极插入到两个通道的入口和出口。3,4,11,12,13,14,15但是, 手动插入和重新加入电极可以很容易地导致放置错误, 从而在测量电阻的变化, 如例如通过微的长期或较短路径的阻力的差异与细胞屏障阻力相比有显著性差异。16为了消除重新插入的错误, 提出了集成电极的器件。然而, 大多数这些集成电极在检查组织培养时阻止视图17,18,19,20,21和/或需要专门洁净室工艺制造。17,22
本出版物中介绍的 organ-on-chip 设备, 首先应用于早期出版物,16将集成电极的稳定性与测量的电池层的可见性结合起来, 并易于制作。该芯片的设计和制作在图 1中进行了描述。总之, 该装置由两个烷 (聚碳酸酯) 部分与通道印记, 是粘合在一起的无泄漏与0.4 µm 孔在两者之间。四白金线电极插入和固定到位与固化胶粘剂井在文化区域外面。所有这些制造步骤都可以使用一般的实验室设备进行, 而不需要一个洁净室环境。最重要的是, 六阻抗测量可以使用这四电极, 从而允许直接隔离的测量 TEER, 独立的电阻的微领先的横断面, 从而尽量减少影响系统中的非生物变体, 如 (重新) 插入错误。16
为了证明这个装置的适用性和直接 TEER 测量, 血脑屏障 (BBB) 被复制在这个芯片。这种生物屏障由专门的内皮细胞组成, 调节血液和大脑之间的运输, 以提供大脑的稳态。23,24为了模拟 BBB, 微流控装置的顶部通道内衬有人脑显微血管内皮细胞, 从 hCMEC/D3 细胞系 (Dr. P-O 提供。Couraud, INSERM, 巴黎, 法国)。25然而, 所提出的方法更普遍地适用于任何具有两个舱室的 organ-on-chip 设备, 从而能够使用易于集成的电极直接 TEER 测定。
本文首先介绍了集成电极 organ-on-chip 装置的制作过程。其次, 对该装置内的脑内皮细胞的播种过程和培养进行了解释, 以及对芯片 TEER 的测量。在结果部分中, 显示了具有代表性的 TEER 测量, 并对数据处理进行了澄清。最后, 对 BBB-on-chip 的屏障功能进行了3天的监测, 表明了所提出的装置和方法对 TEER 的适用性。
在本手稿中, 介绍了一种 organ-on-chip 装置的工程和直接测定在该装置中培养的细胞屏障的 transendothelial 电阻 (TEER)。提出了一种无尘室集成电极的方法, 采用四电极直接 TEER 测定法, 适用于具有两个微流控腔的 organ-on-chip 装置。只要在两个舱室中分离出四电极, 就可以调整芯片布局和几何形状, 以符合预想的实验要求。四电极甚至可以方便地插入到现有芯片的入口, 只要它们在六测量的持续时间内都是固定的。通过改变聚合物/甲苯比, 可以对不同的膜和通道的几何形状进行无泄漏键合的优化。一个更高的甲苯含量导致更薄的自旋涂层的砂浆层26 , 可能更适合在更浅, 更窄的渠道, 在硅橡胶零件。较低的甲苯含量会导致较厚的砂浆层26 , 更适合于将较厚的薄膜封装在该产品的部件之间。
正如在图 2A的示意性阻抗谱和图 2E 和 2F中的实验谱所示, 阻抗测量受电极介质界面上的双层电容的影响。由于微内电极的体积较小, 双层电容可以控制阻抗谱中细胞屏障的电阻高原, 使 TEER 的定量化复杂化。为了克服这一点 , 电极可以入到文化通道前固定。这将增加暴露在培养基中的电极的表面积, 而且双层电容也会增加。这导致电容性倾斜的转移到更低的频率, 因此细胞障碍的抵抗的高原可以更加容易地被认出和定量。虽然两个电极之间的测量路径的电阻会变小, 但这不会影响所提出方法的 TEER 量化。
在通过细胞屏障测量时, 可能会发现额外的电阻高原是不可能被识别的。这可能是两个通道之间的射流连接的结果, 例如, 如果薄膜被砂浆所包围, 就会导致在细胞屏障周围的测量路径。此外, 如果电极由培养基液滴连接, 则在芯片外部可以有电架桥。这通常是结合一个较低的测量阻抗, 可以解决通过消除这一桥梁的培养基。最后, 如果没有电阻高原和测量阻抗是数量级比预期的高, 可能有一个松散的连接在电线或电源。
在未来, BBB-on-chip 的生理相关性可以通过在生理水平上暴露内皮细胞的剪切应力来增加, 这被报道促进血脑屏障的分化和增加屏障的致密性, 很难达到在传统的体外模型中。29此外, 所提出的设备的底部通道提供了一个合适的隔室, 供大脑衍生细胞与内皮共。这也有望增加屏障功能, 也使研究的复杂互动之间的相关细胞类型的病理条件。29
最后, 本出版物中描述的 organ-on-chip 装置可以使用标准的实验室设备制作, 并显示为使用四集成电极的直接 TEER 测量, 不妨碍对所研究的细胞进行目视检查。层.通过模拟该芯片中的 BBB, 并在培养期内监测 TEER, 证明了该装置在上领域的适用性。其他的一些 (障碍) 器官可以被模仿, 包括其他相关的细胞类型进入这个芯片。此外, 测量 TEER 的方法可以很容易地应用在其他两个 compartment-based organ-on-chip 设备, 以达到可重复和有意义的 TEER 值, 可以通过设备和系统进行比较。
The authors have nothing to disclose.
我们感激地感谢约翰引爆制造的模具和 Mathijs Bronkhorst 进行了卓有成效的讨论和协助数据表示。
这项研究的经费来自: SRO 生物医学微冷害 Segerink, 米拉大学生物医学工程和技术医学研究所, 特文特;特文特大学生物医学工程与技术医学研究所 Meer SRO 上;和 VESCEL, 紧急救济会向 A. van 伯格 (669768 号赠款) 提出。
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |