פרסום זה מתאר את הזיוף של המכשיר איברים על שבב עם אלקטרודות משולב על כימות ישירה של ההתנגדות החשמלית transendothelial (TEER). עבור אימות, מחסום הדם – מוח היה חיקה בתוך המכשיר הזה microfluidic, תפקידה מחסום היה במעקב. שיטות הציג אלקטרודה ואינטגרציה כמת TEER ישירה חלים בדרך כלל.
האיברים בצ’יפס, במבחנה מודלים המערבים את התרבות של רקמות (האנושי) בתוך מכשירים microfluidic, הן במהירות המתעוררים הבטחתה לספק שימושי חקר כלי לימוד מחלה ובריאות האדם. כדי לאפיין את הפונקציה מכשול של שכבות תאים תרבותי בתוך איבר על שבב התקנים, נמדד לרוב transendothelial או transepithelial ההתנגדות החשמלית (TEER). למטרה זו, אלקטרודות בדרך כלל משולבים לשבב על ידי שיטות לעבד לספק מדידות יציב יותר מאשר מושגת עם ידני החדרת אלקטרודות לתוך פתחי הכניסה של השבב. אולם, האלקטרודות לעתים קרובות ה”בלתי בדיקה ויזואלית של השכבה תא למד או לדרוש חדר נקי יקר תהליכי ייצור. כדי להתגבר על מגבלות אלה, המכשיר המתוארים כאן מכיל ארבע אלקטרודות משולב בקלות להציב, קבוע מחוץ לאזור תרבות, ביצוע בדיקה ויזואלית אפשרי. באמצעות האלקטרודות ארבע שניתן לכמת את ההתנגדות של שישה נתיבים מדידה, שממנו TEER יכול להיות ישירות מבודדים, עצמאית של ההתנגדות של microchannels תרבות בינוני-מלא. מחסום הדם – מוח ששוכפל במכשיר הזה, TEER שלו נוטרו להראות את הישימות של המכשיר. השבב הזה, האלקטרודות משולבת ושיטת נחישות TEER חלים בדרך כלל באיברים-על-צ’יפס, הן כדי לחקות איברים אחרים או כדי לשלב מערכות איברים על שבב קיימות.
האיברים-על-צ’יפס במהירות מתעוררים כמו חדש, מבטיח כיתת במבחנה רקמות מודלים. 1 במודלים אלו, התאים מתורבתים בתוך מכשירים microfluidic מתוכננים כך שהם מחקים את microenvironment פיזיולוגית של תאים אלה. 1 , 2 התוצאה התנהגות פיזיולוגית או פתולוגית מציאותית יותר של תאים אלה ממה שניתן לצפות קונבנציונאלי במבחנה דגמים של עיצוב פשוט ותפקוד בסיסיים. 3 , 5 , 6 . בנוסף, איברים-על-צ’יפס מספקים סביבה לשליטה יותר מאשר הדגמים ויוו ולשלב יכול בריאים וחולים רקמות ממקור אנושי כדי להעתיק במדויק את הפיזיולוגיה האנושית והן פתולוגיה. ההתקדמות לאחרונה מסוכמים בפיתוח של דם – המוח מחסומים על שבבי (BBBs—צ’יפס) מראים כי השדה הוא נע במהירות קדימה. 7
יתרון נוסף של איברים על שבבי הוא בכך שהם מאפשרים בזמן אמת ומתמשך ניטור של הרקמה תרבותי בתוך המכשיר על ידי מיקרוסקופ, בעזרת ניתוח הביוכימי וחיישני משולב. 1 , 2 לדוגמה, מדידת התנגדות חשמלית, transendothelial או transepithelial (TEER) היא שיטה חזקה עבור ניטור לא פולשני הפיתוח ובהפסקות על הקמת המכשול רקמות. 8 , 9 , 10 TEER הוא ההתנגדות החשמלית על פני מחסום הסלולר ולכן מעיד על תקינות מכשול, חדירות. 10 איברים-על-ומשחקים הסלולר מחסומים בדרך כלל מתורבתים על קרום המפריד בין שני ערוצי fluidic, המייצג את הפסגה, basolateral תאי הרקמה הזאת מכשול. צ ‘ יפס כזה, מדידות TEER יכול להיות בנוחות נערך עם אלקטרודות מוכנס לתוך פתחי הכניסה ועודפים של בין שני הערוצים. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . עם זאת, ההכנסה ידנית ו reinsertion של האלקטרודות במיוחד עלולים לגרום בקלות שגיאות השמה ובכך בווריאציות במחתרת נמדד כמו למשל הבדלי ההתנגדות של נתיבים ארוכים או קצרים יותר באמצעות microchannels משמעותי לעומת ההתנגדות מכשול התא. 16 כדי למנוע שגיאות reinsertion, מכשירים עם אלקטרודות משולב הוצעו. עם זאת, רוב האלקטרודות משולב לחסום את התצוגה בעת בדיקת תרביות רקמה17,18,19,20,21 ו/או לדרוש מיוחדים חדר נקי תהליכי ייצור. 17 , 22
המכשיר איברים על שבב המתוארים בפרסום זה, הראשון מוחל בפרסום קודמות,16 משלב את היציבות של אלקטרודות משולב עם ראות על שכבת תאים נמדד ועל פבריקציה נוספת קלה. עיצוב, ייצור של השבב הזה מתואר באיור1. בקיצור, המכשיר הזה מורכב משני חלקים polydimethylsiloxane (PDMS) עם ערוץ. שמירות אשר מודבקת יחדיו ללא זליגת עם קרום פוליקרבונט עם 0.4 מיקרומטר נקבוביות שביניהם. ארבע אלקטרודות הפלטינה חוט נוסף, קבוע למקום עם photocurable דבק טוב מחוץ לאזור תרבות. כל השלבים האלה פבריקציה נוספת יכול להתבצע עם ציוד כללי, ללא צורך סביבה חדר נקי. נוסף על כך, מדידות עכבה 6 יכול להיעשות באמצעות האלקטרודות ארבע, ובכך לאפשר בידוד ישיר של TEER מדודה, ללא תלות ההתנגדות של microchannels את שהובילו חתך, ובכך למזער את ההשפעה של וריאציות הלא-ביולוגיים במערכת כגון (מחדש) ההכנסה שגיאות. 16
כדי להציג את הישימות של התקן זה ומידות TEER ישירה, מחסום הדם – מוח (BBB) ששוכפל בשבב זה. מחסום ביולוגי זה מורכב של תאים מיוחדים אנדותל ומסדיר תחבורה בין הדם והמוח לתת הומאוסטזה המוח. 23 , 24 לחקות BBB, התעלה העליונה של המכשיר microfluidic היה רצוף האנושי תאי אנדותל מוחין microvascular מהקו תא hCMEC/D3 (באדיבות שסופק על-ידי ד ר פ-או Couraud, INSERM, פריז, צרפת). 25 הציג שיטה זו, עם זאת, באופן כללי יותר רלוונטי לכל מכשיר איברים על שבב עם שני תאים, המאפשרים קביעת TEER ישירה באמצעות בקלות משולב אלקטרודות.
כתב יד זה, תחילה תהליך ייצור של המכשיר איברים על שבב עם אלקטרודות משולב מתואר. הבא, את זריעה השגרה והתרבות של תאי אנדותל המוח בתוך המכשיר הוא הסביר, כמו גם המידות TEER על שבב. במקטע ‘ תוצאות ‘, מדידות TEER נציג מוצגים, עיבוד נתונים מובהר. לבסוף, הפונקציה מכשול של BBB-על-השבב, להשגחה במהלך שלושה ימים, מוצג, מציג את הישימות של המכשיר הציג והשיטות לעקוב אחר TEER.
כתב יד זה, הוצגו ההנדסה של המכשיר איברים על שבב ונחישות ישירה של ההתנגדות החשמלית transendothelial (TEER) של מכשול הסלולר תרבותי במכשיר. שיטת הציג שילוב אלקטרודות ללא ציוד חדר נקי, הקביעה TEER ישירה באמצעות אלקטרודות ארבע ישימה לכל מכשיר איברים על שבב עם שני תאים microfluidic. השבב הפריסה ואת הגיאומטריה יכול להיות מותאם כדי להתאים לדרישות של הניסויים בדיוק, כל עוד ארבע אלקטרודות מופרדות ב שני תאים. האלקטרודות ארבעה אפילו ניתן נוח להוסיף את פתחי הכניסה של האסימונים הקיימים, ובלבד הם הם מקובעים במקום למשך כל המדידות שש. ניתן למטב השיטה ללא זליגת מליטה על ממברנות שונות וגיאומטריה ערוץ על-ידי שינוי היחס PDMS/טולואן. תוכן גבוהה טולואן יוצרת שכבה מצופים ספין דק יותר של חומר מליטה26 וייתכן מתאים יותר רדודים, צר יותר ערוצי בחלקים PDMS. תוצאות תוכן התחתון טולואן ב מרגמה עבה שכבה26 , וייתכן שהוא מתאים יותר להקיף קרום עבה בין החלקים PDMS.
כפי שניתן לראות ספקטרום עכבה סכמטית איור 2 א, ספקטרום ניסיוני איור 2E ולא 2F, מדידות עכבה מושפעים את קיבול שכבה כפולה-הממשק אלקטרודה-בינוני. בשל גודלו הקטן של האלקטרודות בתוך microchannels את, קיבול שכבה כפולה יכול לשלוט על פני רמה resistive המכשול הסלולר עכבה ספקטרה, שמסבך כימות TEER. כדי להתגבר על זה, יכול להיות מוכנס האלקטרודות לעומק ערוצי תרבות לפני קיבוע. זה יגביר את פני השטח של האלקטרודה חשוף למדיום תרבות ועם זה קיבול שכבה כפולה יגדל גם כן. התוצאה היא משמרת של המדרון קיבולי לתדרים נמוכים יותר, כך רמת התנגדות של המכשול סלולרית יכולה להיות מוכרת יותר בקלות, כימות. למרות ההתנגדות של נתיב נמדד בין שתי אלקטרודות יהיו קטנים, זה לא תשפיע על כימות TEER בעקבות השיטה שהוצגו.
בזמן מדידת דרך המחסום הסלולר, זה אפשרי כי רמת התנגדות נוספת ניתן לזיהוי. זו יכולה להיות התוצאה של חיבור fluidic בין שני הערוצים, לדוגמה אם הקרום לקוי מוקף המליטה, המוביל אל נתיב נמדד מסביב למכשול הסלולר. בנוסף, יכול להיות חשמל גישור מחוץ לשבב אם האלקטרודות מחוברים באמצעות droplet של תרבות בינוני. זה בדרך כלל בשילוב עם עכבה נמדד התחתון, יכולה להיפתר על ידי הסרת הגשר הזה של תרבות בינוני. לבסוף, אם יש רמת התנגדות אין והוא עכבה נמדד סדרי גודל גבוה מהצפוי, ייתכן שיש קשר רופף חיווט חשמלי או על מקור הכוח.
בעתיד, הרלוונטיות פיזיולוגיים של הנוכחי BBB-על-השבב יכול להיות מוגברת על ידי חשיפת תאי אנדותל להטיית מתח ברמות פיזיולוגיים, אשר מדווח לקדם BBB בידול, ולהגביר את מחסום אטימות וקשה להשיג קונבנציונלי במבחנה דגמים. 29 . בנוסף, הערוץ התחתון של המכשיר הציג מספק תא מתאים בשביל לתאים במוח, נגזר להיות תרבותי משותף עם אנדותל. זה צפוי גם להגדיל את הפונקציה מכשול ומאפשר גם המחקר של אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים הרלוונטיים בתנאים פתולוגי. 29
לסיכום, המכשיר איברים על שבב המתוארים בפרסום זה יכול להיות מפוברק בעזרת ציוד מעבדה סטנדרטיים ו מוצג לספק מדידות TEER ישירה באמצעות ארבע אלקטרודות משולב הפוגעים לא בדיקה ויזואלית של התא למדה שכבה. תחולתה של התקן זה בשטח איברים-על-צ’יפס הודגם על-ידי מחקה BBB בשבב זה ובפיקוח של TEER במהלך תקופת תרבות. יכול להיות חיקה שורה של איברים אחרים (מכשול) על-ידי כלילת סוגי תאים רלוונטיים אחרים לתוך השבב הזה. בנוסף, שיטה למדידת TEER ניתן להחיל בקלות בהתקנים אחרים שני מבוסס תא איברים על שבב להגיע בערכים TEER משמעותי הדירים ניתן להשוות בין התקנים ומערכות.
The authors have nothing to disclose.
אנו להכיר בהכרת תודה בומר יוהן עבור ייצור של עובש, Mathijs קיטיקונדול עבור דיונים פוריים וסיוע עם ייצוג נתונים.
מחקר זה מומן על ידי: שמיועד ביו Microdevices של l.i. ב Segerink, מירה מכון הנדסה ביו-רפואית ורפואה טכני, האוניברסיטה של טוונטה; הממונה איברים-על-שבבי לספירה ון דר מיר, מירה מכון עבור הנדסה ביו-רפואית ורפואה טכני, האוניברסיטה של טוונטה; VESCEL, ERC Advanced גרנט א ואן דן ברג (גרנט 669768 מס).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |