Diese Publikation beschreibt die Herstellung von einer Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden für die direkte Quantifizierung der Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER). Für die Validierung die Blut – Hirn-Schranke wurde innerhalb dieses Gerät mikrofluidischen nachgeahmt und seiner Barrierefunktion wurde überwacht. Die vorgestellten Methoden zur Elektrode Integration und direkte Quantifizierung der TEER sind allgemein anwendbar.
Organe-on-Chips, in-vitro- Modelle mit der Kultur des (menschlichen) Gewebe in mikrofluidischen Geräten, sind schnell Schwellen- und versprechen, bieten nützliche Forschung Werkzeuge für die menschliche Gesundheit und Krankheit zu studieren. Um die Barrierefunktion der Zellschichten kultiviert im Inneren Organ-on-Chip-Geräte zu charakterisieren, wird oft Transendothelial oder Ttransepitelialen elektrischer Widerstand (TEER) gemessen. Zu diesem Zweck werden Elektroden in der Regel durch Mikromaterialbearbeitung Methoden für stabilere Messungen als manuelles Einfügen von Elektroden in die Buchten von der Chip erreicht wird in den Chip integriert. Aber diese Elektroden häufig behindern Sichtprüfung der untersuchten Zelle Schicht oder erfordern teure Reinraum Prozesse für die Herstellung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, enthält die hier beschriebene Geräte vier leicht integrierte Elektroden, die platziert und fixiert außerhalb den Kultur-Bereich, indem visuelle Inspektion möglich. Verwenden diese vier Elektroden, die der Widerstand der sechs Messstrecken quantifiziert werden kann, von dem kann der TEER direkt, unabhängig von den Widerstand der Nährmedium gefüllten Mikrokanäle isoliert werden. Die Blut – Hirn-Schranke wurde in diesem Gerät repliziert und seine TEER wurde überwacht, um die Anwendbarkeit des Geräts zeigen. Dieser Chip, den integrierten Elektroden und die TEER-Bestimmung-Methode gelten in der Regel in Organe-on-Chips, um andere Organe zu imitieren oder bestehende Orgel-on-Chip-Systeme integriert werden.
Organe-on-Chips sind schnell entwickelt sich eine neue und vielversprechende Klasse von in-vitro- Gewebemodelle. 1 in diesen Modellen sind Zellen in mikrofluidischen Geräten kultiviert, die so konstruiert sind, dass sie die physiologische Mikroumgebung dieser Zellen zu imitieren. 1 , 2 das Ergebnis realistischer physiologische oder pathologische Verhalten dieser Zellen als von konventionellen in-vitro- Modelle von schlichtem Design und grundlegende Funktion erwartet werden kann. 3 , 5 , 6 zusätzlich Organe-on-Chips bieten eine besser steuerbare Umgebung als in Vivo Modelle und gesundem und krankem Gewebe aus menschlichen Ursprungs, treu zu replizieren, menschliche Physiologie und Pathologie zu integrieren. Die kürzlich zusammengefasste Fortschritte in der Entwicklung von Blut – Hirn Barrieren auf Chips (BBBs-on-Chips) zeigen, dass das Feld nach vorne schnell bewegt. 7
Ein weiterer Vorteil der Organe-on-Chips ist, dass sie ermöglichen, in Echtzeit und kontinuierliche Überwachung des Gewebes im Inneren des Gerätes durch Mikroskopie, Online-biochemische Analysen und integrierten Sensoren kultiviert. 1 , 2 Messung Transendothelial oder berührt elektrischen Widerstands (TEER) beispielsweise ist eine leistungsfähige Methode für die Entwicklung nicht-invasiv zu überwachen und die Störung der Barriere-bildenden Gewebe. 8 , 9 , 10 TEER ist der elektrische Widerstand durch eine zelluläre-Schranke und ist deshalb bezeichnend für die Barriereintegrität und Durchlässigkeit. 10 Organe-on-Chips sind zelluläre Barrieren in der Regel auf eine Membran kultiviert, die zwei fluidische Kanäle, Vertretung der apikalen und basolateralen Fächer des Gewebes Barriere trennt. Diese Chips können TEER Messungen bequem mit Elektroden, die in der ein- und Ausgänge der beiden Kanäle eingefügt durchgeführt werden. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 können jedoch manuell einfügen und Wiedereinfügung der Elektroden leicht Platzierung Fehler und damit Schwankungen in der gemessene Widerstand wie z.B. die Unterschiede im Widerstand der längere oder kürzere Wege durch Mikrokanäle führen sind wesentliche Barriere Zellresistenz im Vergleich zu. 16 um Wiedereingliederung Fehler zu beseitigen, sind Geräte mit integrierten Elektroden vorgeschlagen worden. Doch die meisten von diesen integrierten Elektroden blockieren die Ansicht bei der Inspektion der Gewebekultur17,18,19,20,21 und/oder erfordern spezielle Reinraum-Prozesse für die Herstellung. 17 , 22
In dieser Publikation, zunächst in einer früheren Publikation,16 beschriebenen Orgel-on-Chip-Gerät vereint die Stabilität der integrierten Elektroden mit Sicht auf die gemessenen Zellschicht und einfache Herstellung. Die Konstruktion und Herstellung von diesem Chip ist in Abbildung 1dargestellt. Kurzum: dieses Gerät besteht aus zwei Polydimethylsiloxan (PDMS) Teile mit Kanal-Abdrücke, die miteinander verklebt sind leckagefrei mit einem Polycarbonat-Membran mit 0,4 µm Poren dazwischen. Vier Platindraht Elektroden sind eingelegt und fixiert in Stelle mit einem lichthärtenden Klebstoff gut außerhalb der Kulturkreis. Alle diese Fertigungsschritte kann mit Allgemeine Laborgeräte, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum durchgeführt werden. Darüber hinaus können sechs Impedanz Messungen erfolgen mit diesen vier Elektroden, wodurch direkte Isolierung von der gemessenen TEER, unabhängig von den Widerstand der Mikrokanäle der Querschnitt im Vorfeld und minimiert so den Einfluss der nicht-biologischen Schwankungen im System wie z. B. (wieder-) Aufnahme Fehler. 16
Der Anwendbarkeit dieses Gerät und die direkte TEER-Messungen zeigen die Blut – Hirn-Schranke (BBB) in dieser Chip repliziert wurde. Dieser biologische Barriere besteht aus spezialisierten Endothelzellen und regelt Verkehr zwischen Blut und Gehirn zu Gehirn Homöostase. 23 , 24 um die BBB zu imitieren, wurde der obere Kanal des Gerätes mikrofluidischen mit menschlichen zerebralen mikrovaskuläre Endothelzellen aus der hCMEC/D3 Zelllinie (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P.-O. ausgekleidet Couraud, INSERM, Paris, Frankreich). 25 die vorgestellte Methode ist, aber ganz allgemein gilt für jedes Organ-on-Chip-Gerät mit zwei Fächern, ermöglicht direkte TEER-Bestimmung mit leicht integriert Elektroden.
In diesem Manuskript wird zuerst der Fertigungsprozess von der Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden beschrieben. Nächsten Aussaat Verfahren und der Kultur der Gehirn endothelial Zellen im Inneren des Gerätes erläutert, sowie die auf dem Chip-TEER-Messungen. Im Abschnitt “Ergebnisse” repräsentative TEER Messungen gezeigt und Datenverarbeitung ist geklärt. Zu guter Letzt wird die Barrierefunktion der BBB-on-Chip, überwacht während 3 Tagen präsentiert, zeigt die Anwendbarkeit der vorgestellten Geräte und Methoden zur Überwachung von TEER.
In diesem Manuskript wurden das Engineering von einem Organ-on-Chip-Gerät und die direkte Bestimmung der Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) einer zellulären Barriere im Gerät kultiviert vorgestellt. Die vorgestellte Methode der Integration von Elektroden ohne Reinraum Equipment und die direkte TEER-Bestimmung mit vier Elektroden gilt für jedes Organ-on-Chip-Gerät mit zwei mikrofluidischen Fächern. Die Chip-Layout und die Geometrie können an die Anforderungen der anvisierten Experimente angepasst werden, solange die vier Elektroden in zwei Kammern getrennt sind. Die vier Elektroden können auch bequem in die Buchten von vorhandenen Chips eingefügt werden, vorausgesetzt, dass sie für die Dauer von sechs Messungen an Stelle fixiert werden. Leckagefreie Bonding-Methode kann für verschiedene Membranen und Kanal Geometrien durch Ändern der PDMS/Toluol-Verhältnis optimiert werden. Ein höherer Toluol Gehalt führt zu einer dünneren Spin-beschichtete Schicht von Mörtel26 und möglicherweise besser geeignet für flacher und schmaler Kanäle in der PDMS-teilen. Eine niedrigere Toluol Inhalte führt ein dicker Mörtel Schicht26 und möglicherweise besser geeignet, um dickere Membranen zwischen den Teilen PDMS umschließen.
Wie in der schematischen Impedanz Spektren in Abbildung 2A und der experimentellen Spektren in Abbildung 2E und 2Fersichtlich ist, sind die double-Layer-Kapazität an der Elektrode-Medium-Schnittstelle die Impedanz Messungen beeinflusst. Aufgrund der geringen Größe der Elektroden in den Mikrokanälen kann die double-Layer-Kapazität über die resistive Plateau der zellulären Barriere in Impedanz Spektren, Quantifizierung der TEER zu verkomplizieren dominieren. Um dies zu überwinden, die Elektroden eingesetzt werden weiter in die Kultur-Kanäle vor Fixierung. Dadurch erhöht sich die Fläche der Elektrode ausgesetzt auf dem Kulturmedium und damit steigen die double-Layer-Kapazität auch. Dadurch eine Verschiebung der kapazitiven Neigung zu niedrigeren Frequenzen, so dass die resistive Plateau der zellulären Barriere leichter erkannt und quantifiziert werden kann. Obwohl der Widerstand der gemessenen Strecke zwischen zwei Elektroden kleiner werden wird, beeinflusst dies nicht die TEER-Quantifizierung nach der vorgestellten Methode.
Während der Messung durch die zelluläre Schranke, ist es möglich, dass zusätzliche ohmsche Plateau nicht erkannt werden. Dies ist das Ergebnis einer fluidische Verbindung zwischen den beiden Kanälen, z. B. wenn die Membran führt zu einem gemessenen Weg um den zellulären Barriere schlecht durch den Mörtel eingeschlossen ist. Darüber hinaus können elektrische Überbrückung außerhalb des Chips, wenn die Elektroden durch einen Tropfen Kulturmedium verbunden sind. Dies ist in der Regel kombiniert mit einer niedrigeren gemessenen Impedanz und kann durch das Entfernen dieser Brücke Kulturmedium gelöst werden. Schließlich, wenn es kein resistiven Plateau und die gemessenen Impedanz ist um Größenordnungen höher als erwartet, möglicherweise eine lose Verbindung in die elektrischen Leitungen oder an der Stromquelle.
In Zukunft kann die physiologische Bedeutung der aktuellen BBB-on-Chip erhöht werden, indem man die Endothelzellen um Stress bei der physiologischen Ebenen, Scheren, wird berichtet, dass BBB Differenzierung und Erhöhung der Barrier Dichtigkeit zu fördern und ist schwer zu erreichen in konventionellen in-vitro- Modelle. 29 darüber hinaus bietet der unteren Kanal des vorgestellten Geräts eine geeignete Fach für das Gehirn-abgeleitete Zellen zusammen mit dem Endothel kultiviert werden. Dies wird voraussichtlich auch die Barrierefunktion zu erhöhen und auch ermöglicht die Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen zwischen relevante Zelltypen unter pathologischen Bedingungen. 29
Abschließend das Orgel-on-Chip-Gerät in dieser Publikation beschriebenen kann mit standard-Labor-Ausrüstung hergestellt werden und erweist sich bieten direkte TEER-Messungen mit vier integrierten Elektroden, die visuelle Inspektion der untersuchten Zelle nicht behindern Schicht. Die Anwendbarkeit dieses Gerätes im Feld Organe-on-Chips zeigte sich durch Nachahmung der BBB in dieser Chip und Überwachung der TEER während der Kultur. Eine Vielzahl von anderen Organen (Barriere) kann auch andere relevante Zelltypen in diesem Chip nachgeahmt werden. Darüber hinaus kann die Methode zur Messung von TEER leicht angewendet werden, im anderen zwei Fach-basierte Orgel-on-Chip-Geräte, reproduzierbare und aussagekräftige TEER-Werte zu erreichen, die für Geräte und Systeme verglichen werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Wir erkennen dankbar Johan Bomer für die Fertigung von Schimmel und Mathijs Bronkhorst für fruchtbare Diskussionen und Hilfe bei der Darstellung der Daten.
Diese Forschung wurde finanziert durch: SRO biomedizinische Abformverfahren der L.I. Segerink, MIRA Institut für biomedizinische Technik und technische Medizin, Universität von Twente; SRO Organe-on-Chips von n. van der Meer, MIRA-Institut für biomedizinische Technik und technische Medizin, Universität von Twente; und VESCEL, ERC Advanced Grant A. van Den Berg (Grant Nr. 669768).
Materials | |||
Polydimethylsiloxane (PDMS) base agent and curing agent: Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | 1673921 | |
Scotch Magic tape | 3M | ||
Biopsy punch, 1.0 mm diameter | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
Polycarbonate membrane, 0.4 µm pore size | Corning | 3401 | Cut from Transwell culture inserts |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Platinum wire, 200 µm diameter | Alfa Aesar | 10287 | |
UV-curable adhesive: Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
Epoxy adhesive: Loctite M-31 CL Hysol | Henkel | 30673 | |
hCMEC/D3 cells | Human cerebral microvascular endothelial cell line, kindly provided by Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, France | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
Human plasma fibronectin, 20 µg/ml | Gibco | 33016015 | |
Endothelial growth medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | Endothelial basal medium-2 (EBM-2) supplemented with EGM-2 SingleQuots |
Trypsin-EDTA, 0.05% | Gibco | 15400-054 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Oven | Binder | 9010-0190 | |
Spin coater: Spin 150 | Polos | SPIN150-NPP | |
UV light source, 365 nm for 5 s at 350 mW/cm2 | Manufactured in-house | ||
Centrifuge: Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Incubator | Binder | CB E2 150 | |
Boxense | LocSense | Lock-in amplifier with probe cable circuit, specialized for on-chip TEER measurements |