プラズマ医学 - セルを液体からスループット アプローチの基礎的研究

本研究では、プラズマの効果に医学研究のため合理化されたワークフローを述べた。活用する学際的なアプローチは、プラズマ ジェット、液体の主な反応性コンポーネントの基本的な発光プロファイルを分析し、プラズマ (図 1) 処理した細胞の生物学的反応。 このワークフローを実施するには、部品数はプラズマ ソース (図 2) を正しく設定する必要でした。異なるガス (ここで主にアルゴンや酸素や窒素) に供給され、いくつかの質量流量コント ローラーによって制御されます。中央のパネルは、あらかじめ決められたフィード フラックスにマスフロー コント ローラーをデジタル調整に使用されました。ガスは特定フィード ガス組成を生成するため、いくつかマスフロー コント ローラー (図 2A) からガスを組み合わせたバルブのパネルを利用したを物理的に混合しました。プラズマ ソースをつけとプラズマの排水は、USB-分光光度計 (図 2B) 200 の光学範囲で前面に設置された 1,000 nm nm。液体や細胞の治療のため効率的なワークフローは、96 ウェルのプレートを使用して記述されました。ウェルの料理は、その刻印の穴 (図 2C) に一致する挿入とベース プレートに固定されたプラスチック フレームを使ってその場で開催されました。全体のセットアップは、層流フード (図 2D) 下に置かれました。このセットアップには、xyz テーブル プラズマ ジェットの手持ち部分はマウントされているにはが含まれています。後者が十分な大きさのケーブル ポートからおよび xyz テーブル、ベンチ外モータ制御要素を配置できます。重要なは、表はコンピューター制御された、ジェット マイクロメータ精度の各ウェルのセンターを合わせる時間の必要な量のするようにプログラムすることができます。さらに、(我々 のセットアップでは、よく A1) のように開始位置は、(図 2E) を自由に選ばれました。プラスチック プレート ホルダーと共にこれは液体および生物学的実験のセットアップに関連するだけどの日常的なパターンと再現可能なプラズマ処理の許可。 発光分光 (OES) は、異なるフィード ガス条件 (図 3A) で反応性プラズマ コンポーネントにリンクされている明確なピークに使用されました。330 からピークを持つ窒素の 2 番目の肯定的なシステムなど、nm 〜 380 nm 表される活性窒素種 309 nm 表されるヒドロキシラジカル (図 3Aの矢印) でピーク。アルゴン ガスだけを比べると、窒素種の存在は酸素や湿度の減少かそれぞれ低下したかに対し供給ガスに窒素の混合物と増加。対照的に、水酸基の存在は酸素や窒素の減少しますが、加湿アルゴン供給ガスとして使用していた場合に著明に増加しました。液体のプラズマ治療、アルゴンのガスやアルゴン プラズマによる蒸発を求めた最初 (図 3B)。重要なは、プラズマも温度で効果を発揮するので、両方の条件によって同様の結果は出なかった。ヒドロキシラジカルの OES 結果に沿って過酸化水素沈着は大幅減少酸素または窒素の混合したが、加湿供給ガス (図 3C) で増加します。さらに、供給ガスに窒素の添加は、アルゴン プラズマ処理による液体 (図の 3D) と比較して亜硝酸濃度が高かったにつながった。このワークフローは、組成の異なる液体プラズマの影響を調査するも採用があります。たとえば、過酸化水素濃度は、PBS と RPMI1640 細胞培養液 (図 3E) の牛胎児血清の存在の独立したように見えた。同じサンプルでは、血清の存在は、PBS と細胞培養培地の血清非含む対応 (図 3F) と比較して亜硝酸濃度を減少しました。ほとんどの活性酸素は、著しく焼入れ加湿酸素-アルゴン プラズマ (図 3G) 以外の活性酸素生成酸素または窒素の混和材料を用いた乾燥アルゴン ガス条件で生産されました。 ウェルの料理の細胞のプラズマ治療のためプレート含む細胞播種前日にインキュベーターから除去し、プラスチック製のホルダーに追加。プログラムされた治療パターンが適用された、蒸発が補償、20 h. 注、このインキュベーション後細胞培養上清が新しい、空の 96 ウェル プレートに収集され格納されている-のためのインキュベーターに置かれたプレート興味の蛋白質の評価のための 80 ° C。次に、各ウェルの細胞にレサズリンが追加されました。蛍光らに非蛍光レサズリンの売り上げ高は NADPH 生成活性の酵素によって促進されただけと全体的な代謝活動 (図 4A) と相関していた。蛍光強度はプレートの視覚認知に類似していた、長期プラズマ治療 (図 4B) の細胞毒性を示します。加湿ガス条件だった乾燥ガス条件よりも有害。さらに下流アッセイ用プレートの同じセル活かされています。プレートの細胞が顕微鏡 (図 4C) を検討しました。イメージング ソフトウェアを使用して、プレートのいくつかの井戸の定性的な比較 (図 4D) を調べた.総面積の数量が各ウェルに買収視野内のセルで覆われて、それぞれコントロール (図 4E) に正規化された結果のデータを許可するソフトウェア。加湿供給ガス条件で特に、血漿の治療で合計のセル領域の減少を見た。イメージング後、細胞洗浄、カルレティキュリン抗マウス抗体で染色、戸建、, フローサイトメトリー (図 4F) による分析.蛍光カルレティキュリン生菌 (図 4G) の染色強度算出し、(図 4H) のサンプル間比較を意味します。プラズマ処理は、カルレティキュリン乾燥ガス条件で適用されるプラズマ処理時間に相当するマウス メラノーマ細胞表面での発現を誘発しました。加湿供給ガス条件、20 の s と 40 s 治療の誘発より致命的な 60 秒の処理時間と比較して強いカルレティキュリン露出。これは、セルに導入された酸化剤の量に関してカルレティキュリン露出の非線型規制があった示唆しています。 図 1: プラズマ物理学から生物学医学研究のワークフロー 。大気圧アルゴン プラズマ ジェットの反応種の出力は、供給ガスを調節することによって調整されます。分光法を用いたプラズマ気相選択した分子が監視されます。プラズマは、液体を扱うし、酸化沈着を調査に使用されます。マイクロ プレートで培養した細胞がプラズマ処理や生物学的読み出しが行われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: プラズマ研究ベンチのセットアップ。(A) ガス ステンレス パイプは、中央のパネルを介して制御されるいくつかの質量流量コント ローラーに駆動されます。個別供給ガスの組成は、その後バルブのパネルを使用してミックスされます。(B) 様々 な供給ガス組成の違いを調査する発光分光法を用いたプラズマの一部の反応性コンポーネントを監視できます。(C) 高速プラズマ研究、96 ウェル マイクロ プレートを使用します。プログラマブル ・自動化されたプラズマ治療の出発点の定数を確保するため、プレートは、プレートの絶対位置を同じ日を保証するフレームに追加されます。(D) プラズマ ジェットは xyz-テーブルのコンピューター制御の層流フードの下で位置に固定されています。すべての 96 の正確な場所とそれぞれの上プラズマの滞留時間もプラズマ源の動きをガイドするプログラム ファイルに書き込まれます。モーターの制御と同様、プラズマ ジェット装置の主な住宅が近くにあります。(E) 96 ウェル プレートのプラズマ処理を自動化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: プラズマ ジェットと液体分析します。(A) 異なるフィード ガス条件の発光分光が表示されます。窒素の 2 番目の肯定的なシステム (330 nm 380 から nm) 欠席混和剤酸素、窒素の混合と増加され加湿アルゴン (左側パネル) と著しく減少しています。309 でヒドロキシラジカルのピーク nm (矢印) は窒素と酸素の条件で減少したが、加湿アルゴン アルゴン ガスだけと比較して著しく増加します。(B) ガス液体の露出は蒸発をもたらします。プラズマとアルゴン ガス単独での治療に 96well プレートのウェルあたりの蒸発量はだった罰金のスケールを使用して治療の前後にプレートの重さによって決まります。Plasmatreated サンプルの蒸発アルゴン gastreated サンプルにすると高くなって。(C) (A) の水酸基の 309 nm ピークとある程度相関 plasmatreated 液体における過酸化水素の生成。加湿 (5%) アルゴン プラズマは、過酸化物濃度約 4fold を増加しました。(D) 亜硝酸は、供給ガスに窒素を追加しました、この効果は、加湿のアルゴン プラズマとともに増加したときに上昇した.酸素添加減少亜硝酸生成が大幅。(E, F)水素過酸化物と亜硝酸濃度は異なる種類の液体、すなわち RPMI1640 培 (R10F) と、「(R0F) なし PBS 牛胎児血清 (FCS) と同様。血清の存在下で亜硝酸濃度が有意に減少したに対し、過酸化水素レベルは異なるメディア (E) 間差はなかった。(G) スーパーオキ サイド産生だった最も高い乾燥アルゴンのガス供給ガス加湿アルゴンや酸素、窒素の混合は、液体の低活性酸素析出を与えた。(B G) を示すデータは、平均 + 2、3 の実験の SEM です。統計解析実行 (C D) は、それぞれのコントロールに対して供給ガスの乾燥や湿気の多い条件的にグループ全体を比較する一方向の分散分析を使用していた (* * p < 0.01; * * * p < 0.001)。また、アルゴン ガス専用のプラズマ条件は、グループ全体の平均値と t 検定を用いて比較した (### p < 0.001)。さらに統計分析 (F) を t テストそれぞれのプラズマ処理と FCS と FCS のサンプルの中の条件の値を比較することを使用して行った (* p < 0.05; * * p < 0.01);また、FCS や FCS 非含有溶液を t 検定を用いて各プラズマ治療時間内で比較した (# p < 0.05; # p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: プラズマ治療と細胞への影響。(A) 細胞がプラズマにさらされ、レサズリンが代謝活性を評価するために 20 h 後に追加されました。(B) 活動 plasmatreated 試料ガスのコントロールと比較して有意に減少しました。酸素や窒素の添加は両方の乾燥・湿潤のアルゴン ガス条件で毒性につながるに対し、供給ガスの加湿とマーク付きの減少が見られました。(C) 培 propidium ヨウ化 (PI) を追加しました。(D) 概要は、死んだ細胞を識別する (緑) ディジタル位相コントラスト (オレンジ) 各セルと PI の細胞質画分を表すプレートの井戸の表示されます。イメージング ツールは、セルで覆われてもそれぞれ視界にある総面積の定量化を許可しました。(F) 細胞その後洗浄され抗体またはフローサイトメトリーを使用して生物学的プラズマ効果を特徴付ける他のセル マーカーと孵化させます。(G) ゲーティング戦略が採用され、マーカー解析は実行され、サンプル間比較します。(B, E, H) を示すデータを示す平均 + SEM の 1 つの代表を 3 つの独立実験の。スケール バー = 200 μ m (D)。ガス条件ごとにそれぞれのガス制御にそれぞれのプラズマ処理を比較して、差異 (B、H) の双方向の解析に基づく統計的比較を行った (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001)。さらに、窒素や酸素の混和材料の各状態の値がドライのアルゴン プラズマの値と比較し、別々 に湿気のある条件 (双方向による差異; ### p < 0.001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。