JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Plazma tıp - sıvı hücreleri bir üretilen iş yaklaşımı temel araştırma

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56331
, , , , ,
1ZIK plasmatis,Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology

Summary

Bir yüksek-den geçerek soğuk fiziksel plazma tedavi protokolü sıvılar ve hücre gösterilir. Farklı besleme gaz besteleri için plazma ateşleme, plazma ‘s emisyon spectra ve sıvılar ve hücresel hareketlilik daha sonraki analiz plazma tedaviden sonra ölçme kurma içerir.

Abstract

Plazma tıpta, iyonize gazların sıcaklıkları omurgalı sistemlere yakın hücre ve doku için uygulanır. Soğuk plazmasının reaktif türler oluşturmak Redoks bilinen düzenleyen sağlık ve hastalığında biyolojik süreçlerin. Plazma tedavisinin kronik deri Ülseri iyileşmesinde faydalı etkileri önceden klinik ve klinik kanıtlar gösteriyor. Plazma kanser tedavisi gibi diğer gelişmekte olan konular artan ilgi alıyorsunuz. Plazma tıbbi araştırma Fizik, kimya, biyomedikal disiplinler arası uzmanlık gerektirir. Bir plazma araştırma plazma tedavi hücreleri belirli uygulamalar çeşitli karakterize etmek için hedeftir. Bu içerir, örneğin, hücre sayısı ve hücre yüzey marker ifade ve sitokin yayın canlılığı, hücresel oksidasyon, mitokondrial aktivite, sitotoksisite ve hücre ölümü, hücre döngüsü analizi, modu. Bu çalışmanın temel ekipman ve iş akışları böyle plazma Biyomedikal Araştırma için gerekli açıklar. Özellikle onun temel emisyon spectra izleme ve reaktif tür çıktı modüle için gaz ayarlarını yem bir atmosfer basıncı argon plazma jeti, düzgün çalışmasını açıklar. Bir yüksek-tamlık xyz-tablo ve bilgisayar yazılımı kullanarak, jet milisaniyesini duyarlık mikrometre duyarlıklı maksimal tekrarlanabilirlik için 96-şey levha boşluklar üzerinde süpürdü. Redoks aktif moleküllerin sıvı analizi için aşağı akım deneyleri gösterilir ve plazma tedavi hedef hücrelerdir. Özellikle, Melanom hücreleri farklı ardışık deneyleri ama aynı hücreleri kullanarak verimli bir sýrada analiz edilir: ölçüm metabolik aktivite, toplam hücresini alan ve yüzey marker ifade calreticulin, bir molekül için önemli kanser hücrelerinin immünojenik hücre ölümü. Bu deneyleri plazma etkileri hakkında zengin içerikli biyolojik bilgi tek bir plaka almak. Özet olarak, bu çalışmada temel adımları ve plazma Tıbbi araştırmalar için iletişim kuralları açıklar.

Introduction

Reaktif türü önemli Redoks düzenleyiciler hastalığında anormal yara iyileşme1 ve kanser de dahil olmak üzere bulunmaktadır. 2 önemli, bu türlerin patoloji yanı sıra tedavi çözünürlüğü söz konusu. 3 , 4 soğuk fiziksel plazma reaktif pek çok tür ihraç etti iyonize bir gazdır. 5 vücut sıcaklığı6‘ faaliyet sözde soğuk plazmasının advent beri soğuk plazmasının hücre ve dokulara termal zarar vermeden uygulanabilir. Etkinlik ve önceden klinik ve klinik gözlemler plazma cihazların güvenli uygulama göstererek, üç Almanya’da Tıbbi cihaz olarak akreditasyon almış. 7 genotoksik güvenliği ile ilgili olarak özellikle, mutajenik olaylar istimal belgili tanımlık ilk aygıt, bir atmosfer basıncı argon plazma jeti yokluğu çeşitli çalışmalar göstermiştir. 8 , 9 , 10 diğer iki sözde Dielektrik bariyer deşarj (DBD), plazma jet daha farklı bir prensibi ile çalışan cihazlardır. Özellikle, jetler DBD plazmasının daha büyük ama yüzeysel doku alanları tedavisinde etkili ise yüzeyler ve boşluklar neşter gibi tedavisi için izin verir. Hücresel Redoks Sinyal11istismar, teknik amacı plazma tarafından oluşturulan reaktif türler Biyomedikal uygulamalar için kullanmaktır. 12 yara iyileşmesi destek klinik plazma tedavisinin özellikle umut verici bir uygulamadır. 13 , 14 , 15 Ayrıca, plazma antikanser etkileri hayvan modellerinde olduğu gösterildi. 16 , 17 , 18

Etkinliği ve güvenliği hayvan modelleri, ya da düz insana ilişkin plazma uygulamaların doğrulamadan önce vitro araştırma ihtiyaçlarını plazma cihazları ile gerçekleştirilebilmesi için standart. Bu deneyler plazma uygulamaları keşfetmek için ve mekanizmaları işte betimlemek için gereklidir. Ayrıca, temel araştırma kompozisyon reaktif türler ve sonraki biyolojik etkileri etkisini anlamak için gereklidir. Bu çalışma nasıl plazma daha iyi anlamak ve hücreleri üzerindeki etkilerini kontrol için Biyomedikal Araştırma içine entegre edilebilir gösterir. Ayarlama besleme gaz kompozisyon, reaktif tür çıkışını izleme, sıvılar, hücre ve dokulara ve sonuç kimyasal ve biyolojik sonuçlara plazma uygulamaları açıklar. Ayrıca, örnek olan plazma tıbbi araştırma 96-şey levha yapılan yerleştirilen bir vurgu ile plazma tedavi ve aşağı akım biyolojik deneyleri, standardizasyon talimat verilmiştir. Bu yaklaşım farklı avantajlar vardır: Ben) koşulu, reaktif maliyet ve uygulamalı zaman örnek; başına başına gerekli hücre sayısı indirilmesi II) ödenek olarak çoğaltmak veya tedaviler onaylatılacak sonuçlarının daha doğru kolaylıkla ayarlanabilir; ve III) sorunsuz akış aşağı 96-şey biçimi plaka okuyucu, görüntü ve Akış Sitometresi deneyler raporlaması kolaylaştırma.

Protocol

1. plazma tür izleme ve tedavi kurulum Plazma tür izleme İki standart litre / dakika maksimum gaz akı beslemek ve atmosferik basınç plazma jet kullanın. Tüy eksenine dik bir optik emisyon Spektrofotometre önünde jet getirin ve kayıt photoemission ve dalga boyu (200-1000 nm) kullanarak yazılım adanmıştır. Kuru veya oksijen (% 5) besleme gaz oksijen ve azot % 0.5 karıştırın. Optik emisyon spektroskopisi her gaz koşul için yineleyin. Veri grafik ekran için uygun yazılım ile analiz. Plazma tedavi kurulum Bilgisayar temelli xyz tablo için jet düzeltmek. Kuyuları konumunu belirlemek ve tablosuna, her şey ortasına yukarıda uygun tedavi kez katıldı jet taşımak için bir bilgisayar komut dosyası oluşturur. 10 Ekle4 100 µL tam hücre kültür orta memeli yapışık hücreleri herhangi bir tür (RPMI1640% 10 FCS, % 2 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin) laminar akış başlık altında birkaç kuyu içine. Gecede 37 ° C % 5 karbon dioksit ile oksijen bir atmosferde oluşacak şekilde hücresel yapışma sağlar. Plazma 20 için hücrelerle tedavi s 250 µm aralıklarla farklı yüksekliklerde (z ekseni). Propidium iyodür 25 µL hücre kültürü ortamında her şey için ekleyin. Kültür orta hücreleri üzerine bir kenara iterek hücreleri hücre nekroz besleme nedeniyle teşvik değil belirli yüksekliği belirlemek için mikroskop altında gaz görüntü.Not: uzun tedavi süreleri için sıvı buharlaşma plazma ve kapalı modu, bu belirli yükseklikte microliters doubledistilled su yeniden kurmak gerekli miktarı tanımlamak için plazma işlemden önce ve sonra plaka ağırlığında tanımlamak arıtılmış kuyu ozmotik homeostazı. Son bir protokol ile ilgili tedavi kez xyz tablo için hazırlamak (burada: 20 s, 40 s, 60 s plazma ve 60 s gaz kontrolü) ve iyi pozisyonlar ve hazır çok kanallı Pipetler ve rezervuar 96-şey tabak sıvı işleme sonraki deneyleri hakkına sahiptir. 2. reaktif bileşenlerinde büyük plazma tedavi sıvı analizi Hidrojen peroksit plazma tedavi analizi Fosfat tamponlu tuz (PBS) plazma ile 100 µL nüsha düz-alt 96-şey tabak içinde tedavi. PBS 100 µL 10 U horseradish peroksidaz ile ve hidrojen peroksit algılama reaktif 5 mikron yükleyerek bir ana karışım hazırlamak (biri için yeterli iyi; buna göre ölçek). Her şey için 95 µL ana karışımı ekleyin.Not: ortam havası ozon tahlil duyarlılığını azaltmak gibi önceki adımı temiz bir tezgah altında veya plazma kaynak ayrı bir odada yapılmalıdır. Ayrı bir tabak içinde hidrojen peroksit PBS içinde bir iki kat seyreltme serisi 100 µL PBS 100 µM en iyi bir konsantrasyon ile hazırlayın. 5 µL örnekleri veya hidrojen peroksit standartları algılama reaktif içeren wells için ekleyin. Yalnızca arka plan çıkarma eşleştirmeyi sonra için algılama reaktif içeren kuyu bulunmaktadır. Kalenin içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 15 dk için kuluçkaya. Plaka Floresans λex 535 nm ve λem 590 nm ölçme Mikroplaka okuyucu yerleştirin.Not: yüksek peroksit konsantrasyonları örneklerinde bekleniyor Numune dilüsyonu artırılması gerekiyor yoksa, okuma kısa kuluçka süreleri de testin doygunluk önlemek için yapılması. Tüm örnekleri boş değerleri çıkarmak, peroksit standart eğri hesaplamak ve bilinmeyen örnek peroksit konsantrasyonları bu temel eğri üzerinden ölçmek. Plazma tedavi nitrit analizi Flatbottom 96well plakaları nüsha olarak PBS 100 µL plazma ile tedavi. Nitrit algılama çözüm ana karışımı doubledistilled 99 µL için miktar reaktif 1 µL ekleyerek su hazırlar (biri için yeterli iyi; buna göre ölçek). İyi ücret 100 µL açık, flatbottom 96well plakasına ekleyin. Kuyu sayısı için gerektiği gibi büyütmek. Seyreltme serisi doubledistilled suda nitrit standartların hazırlayın. Standartlar veya örnekleri 10 µL 96well tabak içinde ana karışıma ekleyin. Kalenin içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. 5 µL nitrit miktar geliştirici çözüm her şey için ekleyin. Floresans Mikroplaka okuyucu λex 365 nm ve λem 450 nm okuyun. Tüm örnekleri boş değerleri çıkarmak, nitrit standart eğri hesaplamak ve bilinmeyen örnek nitrit konsantrasyonları bu temel eğri üzerinden ölçmek. Plazma tedavi süperoksit analizi Oksitlenmiş sitokrom (1 mg/mL) ana bir karışımını yapmak ve katalaz (20 µg/mL) PBS içinde. 100 µL ana Mix açık, düz dipli 96-şey plaka wells için ekleyin. Plazma ile ana karıştırın nüsha tedavi koşul başına tedavi. 550 Absorbans okumak nm istimal a Mikroplaka okuyucu; Bu veri grafiğini çizin. Sitokrom C molar tükenme katsayısı ve sıvı ışık yolu uzunluğu bir kuyu içinde kullanılarak oluşturulan süperoksit tutarını hesaplar. 3. hücre plazma için maruz biyolojik yanıtı Hücrelerinin plazma tedavi çok boyutlu okuma: metabolik aktivite Laminar akış başlığı tüm aşağıdaki yordamları için kullan. Tohum 104 hücreleri (B16 fare Melanom) 100 µL tam olarak hücre kültür orta düz-alt 96-şey plakaları kuyuda başına desteklenmiştir. Hücresel yapışma gecede kuluçka % 5 karbon dioksit ile oksijen atmosferinde 37 ° C’de izin verir. Xyz-tablo kullanarak, wells plazma veya önceden tanımlanmış bir düzeni göre yalnız gaz ile tedavi ve 20 h için kuluçka makinesi içine geri hücreleri ekleyin.Not: arzu edilirse, supernatants 20 h sonra hücre dışı ürünler analiz etmek almak; 100 µL taze orta daha sonra ekleyin. Her şey için hücre kültürü 500 µM resazurin (son toplama 100 µM); içeren Orta 25 µL Ekle Üç kuyu resazurin hücre kültür orta hücreler için arka plan çıkarma olmadan yalnız içeren hazır olun. Kuluçka 3 h için kuluçkaya. Floresans λex 535 nm ve λem 590 nm içinde Mikroplaka okuyucu okumak. Arka plan Floresans tüm örneklerinden çıkarma ve denetim değerleri için veri normalleştirmek. Hücrelerinin plazma tedavi çok boyutlu okuma: görüntü analizi 3.1.7 iyi plaka kullanın ve süpernatant atın. Taze hücre kültürü 1 µg/mL propidium iyodür içeren orta 100 µL ekleyin. Her şey görüntü için bir motorlu sahne ile mikroskop altında tabak koyun.Not: Görüntüleme ayrıntılar üzerinde deneysel soru değişir; Burada, 20 X objektif bir yüksek-içerik görüntüleme cihazı 3 x 3 alanları bakış parlak alan kanal, dijital faz kontrast kanal ve floresan (propidium iyodür) kanal, uygun uyarma ışık ve emisyon kullanan her iyi okumak için kullanılan filtreler. Kullanım nicel görüntü analiz yazılımı dijital faz kontrast görüntüler tüm alanları bakış toplam sitozolik alan belirlemek için her bir kuyu görüntüsü.Not: Örneğin, uygun ve/veya ölü hücreleri veya adanmış lekeler kullanarak mitokondrial etkinliğini numarasını isterseniz, daha fazla parametreler analiz. Bu çalışmada açıklanan diğer lekeler kullanarak Floresans lekeleri mikroskopi için kullanılan hayalice sonraki Akış Sitometresi deneylerde kullanılan fluorochromes ile örtüşmeyen olduğunu emin olun. Veri grafiğini ve istenirse, metabolik aktivite için elde edilen değerler ile korelasyon için test edin. Hücrelerinin plazma tedavi çok boyutlu okuma: Akış Sitometresi Bu çözümleme için adım 3.2.5 iyi plaka kullanın. Süpernatant atmak ve yıkama iki kez 200 µL kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ile (0.9 mM ile 0,5 mM, sırasıyla).Not: Tamir ve/veya daha fazla hücre içi antijen veya hücre döngüsü analizi boyama gibi bu katkı içinde yer almayan biyolojik veriler için bu aşamada hücreleri permeabilize. Her şey için PBS 50 µL kalsiyum ve magnezyum 50 ng/mL Anti-fare calreticulin monoklonal antikorlar içeren ekleyin. Kuluçka 15dk için kuluçkaya. Yıkama 200 µL ile iki kez tam olarak hücre kültür orta desteklenmiş ve sıvı plaka içinde atın. Her şey için 100 µL hücre dekolmanı çözüm ekleyin ve 20 dk kuluçka için kuluçkaya. Strateji ve kazanç ve gerilimleri, photodetectors geçişi akış sitometrik Alım Protokolü kurulum için başka bir süspansiyon günahı B16 hücre kümesi kullanın. 96-şey plakalar için otomatik örnekleyici ile donatılmış bir Akış Sitometresi plaka yüklemek. En az 1000 ileri hücrelerde ve yan dağılım nüfus genellikle uygulanabilir hücrelerle ilişkili edinme. Akış Sitometresi, faiz, nüfusu kapı için .fcs dosyaları analiz için özel yazılım kullanmak ve calreticulin ortalama Floresans yoğunluğunu belirlemek. Veri grafiğini ve istenirse, metabolik aktivite, görüntüleme ve/veya oksidan ifade için elde edilen değerler ile korelasyon için test edin.

Representative Results

Bu çalışmada, plazma Effects’e tıbbi araştırma için kolaylaştırılmış bir iş akışı açıklanmıştır. Burada kullanılan multidisipliner yaklaşım plazma jeti, sıvı, ana reaktif bileşenlerinde temel optik emisyon profil analiz eder ve biyolojik yanıt hücrelerinin plazma (şekil 1) ile tedavi. Bu iş akışı yürütmek için bir dizi bileşen düzgün plazma kaynağı (Şekil 2) kurmak için ihtiyaç vardı. Farklı gazlar (burada çoğunlukla argon, oksijen ve azot) için temin edildi ve birkaç kütle akış denetleyicileri tarafından kontrol. Merkezi bir panel dijital olarak önceden belirlenmiş besleme gaz Cerayanlar kütle akış denetleyicilerine ayarlamak için kullanıldı. Belirli besleme gaz besteleri vermeye, gazlar fiziksel olarak bir panel gazlar birkaç kütle akış denetleyicilerinden (Şekil 2A) birlikte vanaları kullanan karıştırıldı. Plazma kaynağı açık ve plazma atık bir USB-Spektrofotometre (Şekil 2B) optik aralığı 200 önünde kuruldu nm 1000 nm. Sıvılar ve hücre tedavisi için etkin bir iş akışı 96-şey levhalar kullanılarak tanımlanmıştır. Çok iyi yemekler, baskılı delik (Şekil 2C) eşleşen eklemeleri ile taban plakası tespit edildi bir plastik çerçeve kullanılarak yapıldı. Tüm kurulum bir laminar akış başlık altında (Şekil 2D) yerleştirildi. Bu kurulum xyz-tablo plazma jet el parçası monte edilmiş dahil. İse ikinci dan ve xyz-tablo için yeterince büyük kablo bağlantı noktalarını motor kontrol elemanları tezgah dışında bulunabilir. Önemlisi, tablo bilgisayar kontrollü ve istediğiniz süreyi her şey mikrometre hassasiyetle ortasına jet hover için programlanabilir. Ayrıca, başlangıç konumu (olduğu gibi bizim kurulum, iyi A1) serbestçe (Şekil 2E) seçildi. Plastik plaka sahibi ile birlikte, bu yalnızca sıvı ve biyolojik deneyler kuruluşu ile ilgili herhangi bir gün için günlük varyasyon içeren bir tekrarlanabilir plazma tedavisi için izin verdi. Optik emisyon spektroskopisi (OES) farklı zirveleri reaktif plazma bileşenleri farklı besleme gaz koşullarda (şekil 3A) bağlı takip için kullanıldı. Örneğin, ikinci olumlu sistemi 330 dan zirveleri ile azot nm 380 nm temsil reaktif nitrojen türler ve 309 temsil nm hidroksil radikalleri ( şekil 3Aok) zirve için. Oysa oksijen veya nem eklenmesi azalmış veya sırasıyla azaltmak o, argon gazı yalnız karşılaştırıldığında, azot türlerin varlığı azot karışımı ile besleme gaz haline arttı. Buna karşılık, hidroksil radikalleri varlığı azalmış oksijen veya azot ile ancak oksijen argon besleme gaz olarak kullanıldığında belirgin arttı. Sıvı plazma tedavisinde argon gazı ve argon plazma neden buharlaşma tespit edilmiştir (şekil 3B) ilk. Önemlisi, plazma Ayrıca sıcaklık etkisi giderek artan çünkü koşulların her ikisi de benzer sonuçlar vermemiştir. Hidroksil radikalleri OES sonuçlarını, doğrultusunda hidrojen peroksit ifade önemli ölçüde azalmış oksijen veya azot katkı ile ancak oksijen besleme gazıyla (şekil 3C) arttı. Ayrıca, ek besleme gaz için azot argon plazma tedavi sıvı (şekil 3D) göre anlamlı olarak daha yüksek nitrit konsantrasyonları yol açtı. Bu iş akışı da plazma farklı besteleri ile sıvı üzerinde etkisini araştırmak için istihdam. Örneğin, hidrojen peroksit konsantrasyonları bağımsız olarak fetal buzağı serum PBS ve RPMI1640 hücre kültür orta (şekil 3E) varlığı gibi görünüyordu. Aynı örnekleri, serum varlığı PBS ve hücre kültür onların sigara serum içeren göre (şekil 3F) karşılaştırıldığında orta konsantrasyonlarda nitrit azalmıştır. Çoğu süperoksit kuru argon gazı koşullarında önemli ölçüde oksijen argon-oksijen plazma (şekil 3G) dışında süperoksit üretimi Şoklama oksijen ve/veya azot katkıları ile üretildi. Plazma hücreleri çok iyi yemekler tedavisinde, önceki gün içeren hücreleri seribaşı plaka kuluçka makinesi kaldırıldı ve plastik tutucu ekledi. Programlanmış tedavi desen uygulandı, buharlaşma için telafi edildi ve plaka 20 h. bu kuluçka sonra hücre kültür supernatants bir yeni, boş 96-şey plaka ulaştırılması ve depolandığı için kuluçka makinesi içine geri yerleştirildi- 80 ° C proteinler ilgi değerlendirilmesi için. Sonra resazurin her şey hücrelere eklendi. Floresan floresan resorufin için resazurin ciro yalnızca etkin NADPH üreten enzimler tarafından kolaylaştırdı ve genel olarak metabolik aktivite (şekil 4A) ile ilişkili. Floresans yoğunluklarda plaka görsel algı benzerdi ve uzun süreli plazma tedavisinin (şekil 4B) sitotoksik etkileri belirtti. Oksijen gaz koşulları daha kuru gaz koşulları daha zararlı. Plaka aynı hücrelerinde daha fazla aşağı akım deneyleri için kullanılmıştır. Plaka hücrelerde olduğunu mikroskobik (şekil 4C) araştırıldı. Düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak, plaka birkaç kuyu nitel karşılaştırma (şekil 4D) incelenmiş. Yazılım her kuyuya satın alanların bakış içindeki hücreleri miktar toplam alanın kapsadığı ve sonuçta elde edilen veriler ilgili denetimleri (şekil 4E) normalleştirilmiş izin. Toplam hücre alan bir azalma plazma tedavi örnekleri, özellikle oksijen besleme gaz koşullarla görülmüş. Görüntüleme sonra hücreleri yıkanmış, Anti-fare calreticulin antikorlar ile lekeli, müstakil ve Akış Sitometresi (şekil 4F) ile analiz. Calreticulin (şekil 4G) hücrelerin içinde boyama yoğunluklarda hesaplanır ve örnekleri arasında (şekil 4H) karşılaştırıldığında Floresans demek. Plazma tedavi calreticulin kuru yem gaz koşulları ile uygulanan plazma tedavi süresine denk fare melanoma hücre yüzeyi bir upregulation indüklenen. Besleme gaz koşulları, 20 nemlendirilmelidir için s ve 40 s tedavi indüklenen daha ölümcül 60 s tesir süresi göre daha güçlü bir calreticulin maruz kalma. Bu bir doğrusal olmayan düzenleme calreticulin pozlama hücrelere tanıttı oksidanlar miktarı ile ilgili olarak, olduğunu gösteriyor. Resim 1 : İş akışı plazma Biyoloji fizik gelen tıbbi araştırma. Atmosferik basınç argon plazma jet reaktif tür çıkışını besleme gaz oransal olarak ayarlanmıştır. Plazma gaz aşamasında seçili molekül spektroskopisi kullanılarak izlenir. Plazma sıvı tedavi ve oksidan ifade araştırmak için kullanılır. Mikroplaka içinde kültürlü plazma tedavi hücrelerdir ve biyolojik dökümanları gerçekleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Kurulum plazma araştırma tezgahın. (A)paslanmaz çelik boruları kontrol edilen çeşitli kitle Akış kontrolcüler bir merkezi paneli üzerinden yürütülen farklı gazlar. Bireysel yem gaz kompozisyon bundan sonra kapakların panelini kullanarak karıştırılır. (B) plazma reaktif bazı bileşenleri çeşitli besleme gaz besteleri arasındaki farklar araştırmak için optik emisyon spektroskopisi kullanılarak izlenebilir. (C) yüksek üretilen iş plazma araştırma, 96-şey Mikroplaka kullanılır. Programlanabilir ve otomatik plazma tedavisi için başlangıç noktası sabit emin olmak için plaka günden güne plakaları aynı mutlak konumunu garanti bir kareye eklenir. (D) plazma jet bir bilgisayar kontrollü xyz-Laminer akış başlık altında yer alan tabloya sabittir. Tüm 96 tam konumları ve plazma her bekleme süresi de plazma kaynak hareketini gösterecek bir program dosyasına yazılır. Ana gövdesi motor denetimlerin yanı sıra, plazma jeti aparatı ile yakın bir konumda bulunur. (E) bir 96-şey plaka tedavisinde plazma otomatik. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Plazma jet ve sıvı analizi. (A)optik emisyon spektroskopisi farklı besleme gaz koşullardan gösterilir. İkinci olumlu sistemi azot (330 nm 380 için nm) ile azot, katkı yok oksijen katkı olması durumunda, artan ve belirgin oksijen argon (sol kapı aynası) ile sınırlı. Hidroksil radikalleri 309, zirve nm (ok) azot ve oksijen koşullarında azaldı ama oksijen argon argon gazı yalnız karşılaştırıldığında belirgin artmış. (B) gaz sıvı pozlama buharlaşma için yol açar. 96well plaka üzerine yalnız plazma ve argon gaz ile tedavi bir kuyu başına buharlaşma miktarı iyi bir ölçek kullanarak işlemden önce ve sonra plaka ağırlığında tarafından tespit edilmiştir. Buharlaşma plasmatreated örneklerinde daha argon gastreated örneklerinde buna göre. (C) üretimi hidrojen peroksit plasmatreated sıvılar içinde bir ölçüde (a) hidroksil radikalleri 309 nm pik ile ilişkili. Oksijen (% 5) argon plazma peroksit konsantrasyonları yaklaşık 4fold arttı. (D) nitrit azot besleme gaz eklendi ve bu etkisi ile oksijen argon plazma arttı yüksek. Oksijen ilavesi nitrit üretimi azaldı ama önemli. (E, F) Hidrojen peroksit ve nitrit konsantrasyonları farklı sıvılar, yani RPMI1640 hücre kültür orta (R10F) ile gösterilir ve (R0F) olmadan yanı sıra PBS ve fetal buzağı serum (FCS) olmadan. Peroksit düzeyleri nitrit seviyeleri önemli ölçüde serum huzurunda azalma, ancak farklı medya (E) arasında farklı değil. (G) süperoksit üretimi en yüksek kuru argon gazı gaz; besleme için azot, oksijen veya oksijen argon katkı sıvı içinde alt süperoksit ifade verdi. (B-G) gösterilen veriler ortalama + 2-3 deneyler SEM vardır. İstatistiksel analiz yapıldı gerçekleştirilen (C, D) kullanan tek yönlü kuru veya nemli besleme gaz koşullarına karşı ilgili denetim araçlarının tüm grup karşılaştıran Varyans analizi (** p < 0,01; *** p < 0.001). Ayrıca, argon salt gaz plazma koşullar bütün grup ortalama ve t-testi kullanarak karşılaştırıldı (### p < 0.001). Daha fazla istatistiksel analiz (F) t-testleri her plazma tedavi ve FCS ve FCS olmadan örneklerdeki orta durum değerleri karşılaştırarak kullanılarak gerçekleştirildi (* p < 0,05; ** p < 0,01); Ayrıca, FCS veya sigara FCS içeren çözümler t-testi kullanarak her plazma tedavi süresi içinde karşılaştırıldı (# p < 0,05; ## p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Plazma tedavi ve hücreleri üzerindeki etkisi. (A)hücreler plazma için maruz ve resazurin metabolik etkinliğini değerlendirmek için 20 h sonra eklendi. (B) etkinliği önemli ölçüde plasmatreated örneklerinde gaz kontrollere göre azalma. Ayrıca oksijen ve/veya azot kuru ve nemli argon gazı koşulların her ikisi de toksisite yol açar, ancak belirgin bir azalma ile besleme gaz nemlendirme görüldü. Propidium iyodür (PI) içeren (C) orta eklendi. (D) genel bir bakış ile dijital faz kontrast (turuncu) her hücre ve PI sitozolik kısmını temsil eden plaka Wells (ölü hücreleri tanımlamak için yeşil) gösterilir. Görüntüleme araçları her iyi hücrelerle kapalı görüş alanı içinde Toplam alan miktarının izin. (F) hücreleri daha sonra yıkanmış ve antikorlar veya biyolojik plazma etkileri Akış Sitometresi kullanılarak karakterize etmek için diğer hücre işaretleri ile inkübe edildi. (G) Gating stratejileri istihdam ve marker analizi gerçekleştirilen ve örnekleri arasında karşılaştırıldığında. (B, E, H) gösterilen verileri belirtmek ortalama + SEM üç bağımsız deneyler bir temsilcisi. Ölçek çubuğu 200 µm (D) =. İstatistiksel karşılaştırma yapılacak iki yönlü varyans karşılaştırarak, her gaz koşul için her plazma tedavi onun ilgili gaz kontrolü için (B, H) analizini kullanarak (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0.001). Ayrıca, azot ve/veya oksijen katkıları her koşul için değerler argon gaz plazma için Kuru değerlerine karşılaştırıldı ve nemli ayrı ayrı koşullar (iki yönlü varyans; analizini ### p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Temel araştırma etkinliğini ve plazma ilaç preklinik ve klinik araştırmalarda destek mekanizmaları bir anlayış geliştirmek için esastır. Temel araştırma Ayrıca soruşturma tedaviler için yeni uygulamalar teşvik etmektedir. Plazmaları Reaktif oksijen ve azot türler19nesil aracılığıyla biyolojik etkileri arabuluculuk de oluşturulduktan iken, hala alanına üç ana sorun vardır. İlk olarak, hangi tür önemlidir? Bu kısmen plazmasının optik tanılama ve biyolojik çıktıları ile besleme gaz bileşimi oransal tarafından cevaplanabilir. 20 ikinci olarak, ne etkileri hücreleri gibi biyolojik hedefler görülebilir? Bu en azından kısmen, hücre kültürü deneyleri ve deneyleri bir sayısını kullanarak ele olduğunu. Ökaryotik hücrelerde etkileri pleiotropic dahil olmak üzere hücre döngüsü tutuklama21, Apoptozis22, nekroz23ve cilt hücre stimülasyon24,25,26yanı sıra bir destek vardır veya hücrenin azaltmak motilite veya metabolik aktivite27,28,29. Bu pleiotropic etkileri, ilgili üçüncü meydan okuma, hücresel yanıt için farklı efektler sık görülen farklı hücre tiplerinde açıklamak için plazma kaynaklı oksidanlar belirlemek anahtar molekülleri belirlemektir. Bu omics teknikleri30,31,32 ve/veya kadar yapılabilir veya downregülasyon siRNA (redoks) inhibitörleri, antioksidanlar ve antioksidan enzimler yanı sıra, modülasyon sinyali kullanarak hedef genlerin Plazma’nın reaktif tür çıktı. 33 , 34 , 35 dolayısıyla, çok sayıda yineleme ile daha büyük örnek kümelerini test etmek için aerodinamik tahlil iletişim kurallarına gerek.

Bu çalışmada bir verimli deneysel iş akışı, biyoloji, söz konusu sorunları ile ilgili olarak plazma Tıbbi araştırmalar için fizik örneğidir. Plazma kaynağı ve plazma üretimi mühendisliği yönleri ile ilgili ayrıntılar daha önce tarif edilmistir. 36 , 37 , 38 birçok avantajı vardır 96well levha, tüm bu deneyleri yapılmaktadır. Örneğin, hücre kültürü supernatants gibi örnekleri kolayca tahlil koleksiyonu plakaları araştırmaya, örneğin, protein konsantrasyonları ile enzim-bağlantılı-immunosorbent-tahlil için yapılabilir. Bilimsel ekipman 96-kuyulardan doğrudan okuma yeteneğine varsa, böyle bir yaklaşım örnek ve handsontime maliyeti en aza indirir ve sonuçları aynı örnekten farklı deneyleri çoğullama tarafından en üst düzeye çıkarır. Çok kanallı kullanımı Ayrıca Pipetler örnek işleme hızlandırır. Bu ek pipetting adımlar diğer tüpler ve aşağı akım deneyleri kapları gerektirir rağmen prensip olarak, burada açıklanan tahlil de büyük iyi çapları ile iyi plaka biçimleri kullanarak yürütülen olabilir. 384well levha gibi daha küçük tabak türleri ancak, geometri jetleri ile büyük besleme gaz Cerayanlar kullanarak Biyomedikal plazma araştırma için uygun mevcut değil. Özellikle, yalnızca tek ama değil bitişik wells bir tedavi sırasında etkilenir garanti edilemez.

Sıvı analiz tür ifade tarafından plazma araştırmak için esastır. Uzman analizleri içinde farklı deneyleri paralel bir kurulumunu aynı anda plasmatreated sıvılar farklı oksidanlar ile ilgili olarak karakterize olabilir. Bu çoklama plasmaderived türlerin farklı bir resim geliştirme sağlar. Açıklanan yaklaşım hidrojen peroksit konsantrasyonları39, hangi genellikle gerekli ancak plazma etkileri açıklamak her zaman yeterli olduğunu araştırmak için son derece duyarlıdır. 40 , 41 , 42 biyolojik ilgili etkileri de sıvı burada bulunmayan bir glutatyon tahlil ile değerlendirilebilir. 43 belirli nitrit tahlil 10fold daha yüksek tahlil hassasiyet (veri gösterilmez) nedeniyle konvansiyonel Griess deneyleri üzerinde önemle önerilir. Plasmatreated sıvı Hipokloröz asit DTNB tahlil kullanarak oluşumu için soruşturma olması. Henüz, önceki sonuçları plazma kaynağımız bu türü oluşumu işaret vermedi. 19 , 39 , 44 plazma tedavi bittikten sonra tür bozulma zaman içinde yer alır. Nitrit nitrat için tepki verir; Ayrıca, peroksit zaman içinde tüketilmektedir. Ancak, bu işlem birkaç saat sürebilir. 35 sitokrom c emme birkaç saat içinde de durumu iyi. Bu nedenle, işlemleri tedaviden sonra ilk 30 dk içinde oluşursa, burada açıklanan uzun ömürlü tür konsantrasyonları varyasyon ihmal edilebilir. Medya (örneğin, Dulbecco’nın modifiye kartal orta) belirli türde maddeler soruşturma kadar % 90 peroksit 1 h (veri gösterilmez) içinde için kayıt atmak ancak, bakım alınmalıdır peroksit plazma yükünün bir küçümseme önde gelen sıvılar.

Çok katmanlı bir tahlil hangi aralıkları hücre alana (Morfoloji) metabolik aktivite soruşturma hücre yüzey marker ifade için sunulmaktadır. Bu deneyleri kombinasyonu ilginç sonuçlar ortaya çıkarabilir. Örneğin, biz daha önce THP1 monosit metabolik aktivite ve hücre sayımları plazma maruz takip doğrusal bir biçimde azaltamaz olduğunu göstermiştir. Plazma tedavi süresi, artan ile 45 aksine, bu boyut olarak büyütülmüş ve böylece daha yüksek metabolik oranları bir percell olarak önde gelen bir daha yüksek mitokondrial kitle vardı hücreleri tespit edildi. Esasen, multiplate okuyucu, mikroskobu ve Akış Sitometresi hücresel yanıt plazma tedavi aşağıdaki hakkında bilgi multiplexes. Melanom hücreleri, sitotoksik efekt ve calreticulin tarafından aracılı onların immünojenisite üzerinde odaklanabilir. 46 prensip olarak, diğer pek çok soru metabolik aktivite görüntüleme ve Akış Sitometresi sonuçları ile bağlama Bu yaklaşımla saptanabilir. Örneğin, hücre farklılaşması (örneğin makrofaj polarizasyon), mitokondri zar potansiyeli, hücre döngüsü analizi, hücre hareketliliği, biyomekanik veya çözümleme için Mikronukleus oluşumu genotoxicity da içinde araştırılması hücreler plazma tedavi. Çok renkli Akış Sitometresi aynı anda farklı hücre popülasyonlarının içinde bile daha fazla uygulama için izin verir. Bu, örneğin, proteinler transkripsiyon faktörleri, mRNA miktar, hücre içi sitokinler ölçümü ve/veya tek hücre düzeyinde toplam azaltılmış thiols değerlendirilmesi gibi sinyal fosforilasyon durumu analizini içerir. Her örnek için kullanılabilir ek biyolojik ilgili bilgi daha fazla plazma Redoks etkileri resmini geliştirmede mevcut ve gelecekteki plazma uygulamaları daha iyi anlamak için yardımcı olur.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alman Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma fon (BMBF vermek numaraları 03Z22DN11 ve 03Z22DN12) minnetle kabul edilmektedir.

Materials

accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -. D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen – A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins–molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -. D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -. D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).

Tags

Plasma MedicineMulti-well AssayOptical Emissions SpectroscopyLiquid AnalysisCellular ActivityMicroscopyFlow CytometryPlasma-derived Reactive SpeciesImmunogenic Cancer Cell DeathSemi-automated Approach96-well PlatePlasma JetSuperoxide AnalysisCell Metabolic ResponseResazurin Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine – A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image