JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Basisonderzoek in Plasma geneeskunde - een benadering van de doorvoer van vloeistoffen naar cellen

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56331
, , , , ,
1ZIK plasmatis,Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology

Summary

High-throughput verkouden fysieke plasma behandeling protocol van vloeistoffen en cellen wordt weergegeven. Het gaat om de oprichting van verschillende grondstof gas composities voor plasma ontsteking, meten van de plasma emissie spectra, en de daaropvolgende analyse van vloeistoffen en cellulaire activiteit na plasma behandeling.

Abstract

In plasma geneeskunde, worden geïoniseerde gassen met temperaturen dicht bij die van de gewervelde systemen toegepast op de cellen en weefsels. Koude plasma’s genereren reactieve soorten bekend bij redox reguleren van biologische processen in gezondheid en ziekte. Pre-klinische en klinische gegevens wijzen op de gunstige effecten van plasma behandeling in de genezing van chronische ulceratie van de huid. Andere opkomende onderwerpen, zoals de behandeling van de kanker van het plasma, krijgen steeds meer aandacht. Plasma medisch onderzoek vereist interdisciplinaire expertise in natuurkunde, scheikunde en biologie. Doel van het onderzoek van plasma is te karakteriseren van plasma-behandelde cellen in een verscheidenheid van specifieke toepassingen. Dit omvat, bijvoorbeeld cellen en levensvatbaarheid, de cellulaire oxidatie, de mitochondriale activiteit, de cytotoxiciteit en de modus van de dood van de cel, celcyclus analyse, cel oppervlakte marker expressie en cytokine release. Deze studie beschrijft de essentiële apparatuur en vereiste voor dergelijk onderzoek in plasma biogeneeskunde werkstromen. Hierin wordt de werking van een atmosferische druk argon plasma jet, specifiek toezicht op haar fundamentele emissie spectra en diervoeders gas instellingen om te moduleren van reactieve soorten uitvoer. Met behulp van een hoge-precisie xyz-tabel en de computersoftware, is de jet zweefde in milliseconde precisie over de gaatjes van 96-wells-platen in micrometer-precisie voor maximale reproduceerbaarheid. Stroomafwaarts testen voor vloeibare analyse van redox-actieve moleculen worden weergegeven, en doelcellen zijn plasma-behandeld. Specifiek, melanoom cellen worden geanalyseerd in een efficiënte opeenvolging van verschillende opeenvolgende tests maar met behulp van dezelfde cellen: meting van de metabole activiteit, cel totaal gebied en oppervlakte marker expressie van calreticulin, een molecule die belangrijk zijn voor de immunogene celdood van kankercellen. Deze testen ophalen tevreden-rijke biologische informatie over plasma effecten uit een enkele plaat. Over het geheel genomen is deze studie beschrijft de essentiële stappen en protocollen voor plasma medisch onderzoek.

Introduction

Reactieve soorten zijn belangrijke redox regelgevers in ziekte, met inbegrip van abnormale wond genezing1 en kanker. 2 nog belangrijker is, zijn deze soorten betrokken in de pathologie, alsmede zijn therapeutische resolutie. 3 , 4 koude fysieke plasma is een geïoniseerd gas die reactieve soorten vele soorten verdrijft. 5 sinds de komst van de zogenaamde koude plasma’s die op lichaam temperatuur6 opereren, koude plasma kunnen worden toegepast op cellen en weefsels zonder thermische schade. Door aan te tonen de werkzaamheid en veilige toepassing van plasma apparaten in pre-klinische en klinische waarnemingen, heb drie accreditatie ontvangen als medische hulpmiddelen in Duitsland. 7 vooral met betrekking tot de veiligheid van de genotoxische, verschillende studies hebben aangetoond de afwezigheid van mutagene gebeurtenissen met behulp van het eerste apparaat, een atmosferische druk argon plasma jet. 8 , 9 , 10 de andere twee apparaten zijn zogenaamde diëlektrische barrière lozingen (DBD), die via een ander principe dan plasma jet werken. Specifiek, toestaan stralen voor scalpel-achtige behandeling van oppervlakken en Holten overwegende dat DBD plasma’s efficiënt zijn in het behandelen van grotere maar nogal plat weefsel gebieden. Exploitatie van cellulaire redox signalering11, is het doel van de techniek plasma gegenereerde reactieve soorten voor biomedische toepassingen gebruiken. 12 een bijzonder veelbelovende toepassing van klinische plasma therapie is de steun van de wondgenezing. 13 , 14 , 15 voorts plasma werd aangetoond dat de antikanker effecten hebben in diermodellen. 16 , 17 , 18

Gestandaardiseerd voor het valideren van de werkzaamheid en veiligheid van plasma toepassingen in diermodellen, of zelfs mensen, in vitro onderzoek moet worden uitgevoerd met plasma apparaten. Deze experimenten zijn essentieel om te verkennen plasma toepassingen en om af te bakenen de mechanismen op het werk. Bovendien, fundamenteel onderzoek is nodig om te begrijpen de impact van de samenstelling van reactieve species en latere biologische effecten. Deze studie toont aan hoe plasma kan worden geïntegreerd in biomedisch onderzoek om beter te begrijpen en beheersen van de gevolgen ervan voor de cellen. Het beschrijft de afstemming van de grondstof gassamenstelling, de monitoring van reactieve soorten uitvoer, de toepassingen van plasma vloeistoffen, cellen, weefsels en de daaruit voortvloeiende resultaten van chemische en biologische. Bovendien voorbeelden gegeven die instrueren over de normalisatie van plasma behandeling en downstream biologische testen, met een nadruk op plasma medisch onderzoek gedaan in 96-wells-platen. Deze aanpak heeft verschillende voordelen: ik) minimalisering van het aantal cellen nodig per voorwaarde, reagens kosten en hands-on tijd per monster; II) correctie van grotere nauwkeurigheid van de resultaten zoals tweevoudige of drievoudige behandelingen kunnen worden ingesteld met gemak; en iii) vergemakkelijking van naadloze downstream keuring in 96-Wells-indeling afleesapparaat, imaging en stroom cytometry experimenten.

Protocol

1. plasma soorten bewaking en behandeling Setup Plasma soorten toezicht Een luchtdruk plasma jet gebruiken en een maximum van twee standaard liter per minuut voeden gas flux. Loodrecht op de as van de pluim, plaatst u de straal voor een emissie van optische spectrofotometer, en record photoemission en golflengte (200-1000 nm) met behulp van specifieke software. Meng 0,5 of meer gewichtspercenten stikstof of zuurstof naar droge of bevochtigde (5%) grondstof gas. Herhaal emissie van optische spectroscopie voor elke voorwaarde van gas. Analyseren met de software geschikt voor grafische weergave van gegevens. Plasma behandeling setup De jet naar een computer gestuurde xyz-tabel vast te stellen. De positie van de putten identificeren en genereren een script van de computer te verplaatsen van de jet aan de tafel, met de juiste behandeling tijden, boven het midden van elk putje toegevoegd. Voeg 104 van elk soort aanhangend zoogdiercellen in 100 µL cultuurmedium van de volledige cel (RPMI1640 met 10% FCS, glutamine van 2% en 1% penicilline/streptomycine) in verschillende putten onder de motorkap van een laminaire flow. Het toestaan van cellulaire hechting op ‘s nachts optreden bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% kooldioxide. Behandelen van de cellen met plasma voor 20 s op verschillende hoogtes (z-as) 250 µm tussenpozen. Voeg 25 µL van propidium jodide in cel kweekmedium aan elk putje. Beeld de cellen onder de Microscoop om te bepalen van de specifieke hoogte die niet toe cel necrose als gevolg van de feed brengt er gas het kweekmedium bovenop de cellen opzij duwen.Opmerking: Voor langere behandeling tijden, identificeren vloeibare verdamping op deze bepaalde hoogte, in plasma in- en uitschakelen modus, door weging van de plaat voor en na behandeling van het plasma te identificeren van de hoeveelheid microliters van doubledistilled water nodig om te herstellen osmotische homeostase in de behandelde putten. Een Slotprotocol voorbereiden op de xyz-tabel met respectievelijke behandeling tijden (hier: 20 s, 40 s, 60 s plasma en 60 s gasbeheersing) en goed posities, en hebben klaar meerkanaals pipetten en reservoirs voor vloeibare behandeling van 96-wells-platen in latere testen. 2. analyse van belangrijke reactieve componenten in Plasma-behandelde vloeistoffen Analyse van waterstofperoxide Plasma-behandeld Behandelen 100 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met plasma in drievoud in flat-onderkant 96-wells-platen. Voorbereiding van een master mix door het laden van 100 µL van PBS met 10 U van mierikswortelperoxidase en 5 µM van waterstofperoxide detectie reagens (voldoende voor een goed; schaal omhoog dienovereenkomstig). Voeg 95 µL van master mix toe aan elk putje.Opmerking: De vorige stap moet worden uitgevoerd onder een schone bankje of in een kamer die verschilt van de plasma-bron zoals omgevingslucht ozon de gevoeligheid van de test kan verminderen. In een afzonderlijke plaat, bereid een tweevoudige verdunningsreeks van waterstofperoxide in PBS met een hoogste concentratie van 100 µM in 100 µL PBS. Breng 5 µL van monsters of waterstofperoxide normen in putjes met het detectie-reagens. Omvatten putten met detectie reagens alleen voor achtergrond aftrekken na de uitlezing. Laat de plaat in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Plaats de plaat in de lezer van de microplate meten fluorescentie bij λex 535 nm en λem 590 nm.Opmerking: Als hoge peroxide concentraties worden verwacht in de monsters, de monsterverdunning moet worden verhoogd of lezingen met kortere incubatietijd pauzes om te voorkomen dat de verzadiging van de test moeten worden gedaan. Aftrekken van lege waarden van alle monsters, de peroxide standaard curve berekenen en kwantificeren van onbekende peroxide monsterconcentraties uit die basislijn kromme. Analyse van nitriet Plasma-behandeld 100 µL van PBS met plasma in drievoud in flatbottom 96well platen moeten worden behandeld. Voorbereiding van een master mix van nitriet detectie oplossing door toevoeging van 1 µL van kwantificering reagens aan 99 µL van doubledistilled water (voldoende voor een goed; schaal omhoog dienovereenkomstig). Voeg 100 µL per putje aan een duidelijke, flatbottom 96well-plaat. Opschalen zo nodig voor het aantal putten. Voorbereiden van een verdunningsreeks van nitriet normen in doubledistilled water. Voeg 10 µL van normen of monsters aan de master mix in 96well platen. Laat de plaat in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Voeg 5 µL van nitriet kwantificering ontwikkelaar oplossing aan elk putje. Lees fluorescentie in een microplate-lezer op λex 365 nm en λem 450 nm. Aftrekken van lege waarden van alle monsters, berekenen de standaard curve van nitriet en kwantificeren van onbekend monster nitriet concentraties die basislijn kromme. Analyse van Plasma-behandelde Superoxide Maken van een master mix van geoxideerde cytochroom (1 mg/mL) en katalase (20 µg/mL) in PBS. Breng 100 µL van master mix in de putjes van een duidelijke, flat-onderkant 96-wells-plaat. De master mix met plasma in drievoud per behandeling voorwaarde moeten worden behandeld. Lees de absorptie bij 550 nm met behulp van een microplate lezer; grafiek van deze gegevens. Bereken de hoeveelheid superoxide gegenereerd met behulp van de coëfficiënt van de molaire extinctie van cytochroom C en de lichte weglengte van vloeistof in een put. 3. de biologische reactie van cellen die zijn blootgesteld aan Plasma Multidimensionale uitlezing van Plasma-behandelde cellen: metabole activiteit Gebruik een laminaire flow-kap voor alle van de volgende procedures. Volledig aangevuld zaad 104 cellen (B16 lymfkliertest melanoom) in 100 µL cultuurmedium cel per putje in flat-onderkant 96-wells-platen. Laat ‘s nachts cellulaire hechting bij 37 ° C in de bevochtigde sfeer van de incubator met 5% kooldioxide. De xyz-tabel gebruikt, behandelen van putjes met plasma of gas alleen op basis van een vooraf gedefinieerde schema, en voeg de cellen terug in de incubator voor 20u.Opmerking: Indien gewenst, opstijgen supernatant na 20u voor het analyseren van extracellulaire producten; Voeg 100 µL van verse medium daarna. Voeg aan elk putje, 25 µL van cel kweekmedium dat 500 µM resazurin (eindconcentratie 100 µM); bereiden drie putten met resazurin alleen in cel kweekmedium zonder cellen voor achtergrond aftrekken. Incubeer gedurende 3U in de incubator. Lees de fluorescentie bij λex 535 nm en λem 590 nm in een microplate-lezer. Aftrekken achtergrond fluorescentie van alle monsters en normaliseren van de gegevens naar waarden van besturingselementen. Multidimensionale uitlezing van Plasma-behandelde cellen: analyse van het beeld Gebruik van de goed plaat boven 3.1.7 en weggeworpen. Voeg 100 µL van verse cel kweekmedium dat 1 µg/mL propidium jodide. Zet de plaat onder een microscoop met een gemotoriseerde fase om het imago van elk putje.Opmerking: Imaging details hangt de experimentele vraag; hier, werd een 20 X doelstelling gebruikt in een beeldapparaat high-inhoud te lezen van weergave van de velden van de 3 x 3 in elk putje in een heldere veld kanaal, digitale fase contrast kanaal en fluorescentie (propidium jodide) kanaal, met behulp van passende excitatie licht en emissie filters. Gebruik de software van de analyse van de kwantitatieve afbeelding om te bepalen van de totale cytosolische oppervlakte in digitale fase contrast beelden van alle gezichtsveld beeld in elk putje.Opmerking: Analyseren verdere parameters indien gewenst, bijvoorbeeld, het aantal levensvatbare en/of dode cellen of mitochondriale activiteit met behulp van speciale vlekken. Als andere vlekken dan in dit werk beschreven, controleert u of dat fluorescentie vlekken gebruikt voor microscopie niet spectraal met de fluorochromes gebruikt in daaropvolgende stroom cytometry experimenten overlappen. Grafiek van de gegevens, en indien gewenst, test voor correlatie met de waarden die zijn verkregen voor de metabole activiteit. Multidimensionale uitlezing van Plasma-behandelde cellen: Stroom Cytometry Voor deze analyse, door de goed plaat uit stap 3.2.5 te gebruiken. Verwijder het supernatant en spoel tweemaal met 200 µL van PBS met calcium en magnesium (0,9 mM en 0,5 mM, respectievelijk).Opmerking: Fix en/of permeabilize cellen in dit stadium voor verdere biologische uitlezingen niet behandeld in deze bijdrage, zoals de kleuring van intracellulaire antigeen of celcyclus analyse. Voeg aan elk putje, 50 µL van PBS met calcium en magnesium met 50 ng/mL anti-muis calreticulin monoklonale antilichamen. Incubeer gedurende 15 min. in de incubator. Wash tweemaal met 200 µL van volledig aangevuld cel kweekmedium en gooi de vloeistof in de plaat. Voeg 100 µL van cel detachement oplossing aan elk putje en incubeer gedurende 20 min. in de incubator. Een andere set onbevlekt B16 cellen in suspensie gebruiken om setup van het stroom cytometrische overname protocol, gating strategie, en de winsten en de spanningen van de fotodetectoren. Laad de plaat in een stroom cytometer uitgerust met een automatische sampler voor 96-wells-platen. Verwerven van een minimum van 1.000 cellen in de voorwaartse en kant scatter bevolking meestal geassocieerd met levensvatbare cellen. Gebruik software gewijd voor de analyse van stroom cytometry, .fcs bestanden naar de poort van de bevolking van belang, en het bepalen van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van calreticulin. Grafiek van de gegevens, en indien gewenst, test voor correlatie met de waarden die zijn verkregen voor de metabole activiteit, imaging, en/of oxiderend afzetting.

Representative Results

In deze studie werd een gestroomlijnde workflow beschreven voor medisch onderzoek naar de effecten van plasma. De multidisciplinaire aanpak gebruikt hier analyseert het fundamentele optische emissie-Profiel van de plasma-jet, de belangrijkste reactieve componenten in de vloeistof, en de biologische reacties van cellen behandeld met plasma (Figuur 1). Een aantal onderdelen nodig waren om uit te voeren deze workflow, correct instellen van de plasma-bron (Figuur 2). De verschillende gassen (hier voornamelijk argon, zuurstof en stikstof) werden geleverd aan en gecontroleerd door verschillende massastroom controllers. Een centrale paneel werd gebruikt voor het digitaal aanpassen de massastroom controllers aan vooraf bepaalde grondstof gas fluxen. Om specifieke grondstof gas composities, waren de gassen fysiek gemengd gebruik makend van een panel van kleppen die gecombineerd van gassen uit verschillende massastroom controllers(Figuur 2). Het bronpakket plasma was ingeschakeld en het plasma effluent opgericht voor een USB-spectrofotometer (Figuur 2B) met een optisch bereik van 200 nm tot 1.000 nm. Voor behandeling van vloeistoffen en cellen, werd een efficiënte workflow beschreven met behulp van 96-wells-platen. Multi goed gerechten werden gehouden in plaats met behulp van een plastic frame frame dat is vastgesteld op de grondplaat met ingevoegde afgestemd op haar ingeprinte gaten (Figuur 2C). De volledige opstelling werd geplaatst onder de motorkap van een laminaire flow (Figuur 2D). Deze opstelling opgenomen een xyz-tabel waarnaar de hand-held stuk van de plasma-jet werd gemonteerd. De motorische controle-elementen bevinden zich buiten de Bank, als de laatste beschikt over voldoende grote kabel poorten van en naar de xyz-tabel. Nog belangrijker is, de tafel was computergestuurde en kan worden geprogrammeerd om de jet zweven boven het midden van elk putje met een micrometer nauwkeurigheid voor de gewenste hoeveelheid tijd. Bovendien was de startpositie (zoals in onze opstelling, goed A1) vrij gekozen(Figuur 2). Samen met de houder van de kunststof plaat hierdoor voor een reproduceerbare plasma behandeling met dagelijkse wijzigingen uitsluitend gerelateerde aan de opstelling van de vloeibare en biologische experimenten. Emissie van optische spectroscopie (OES) werd gebruikt om de verschillende toppen gekoppeld aan reactieve plasma onderdelen in verschillende grondstof gas voorwaarden (Figuur 3A) volgen. Bijvoorbeeld, de tweede positieve stelsel van stikstof met pieken van 330 nm tot 380 nm vertegenwoordigd reactieve stikstof soorten, en de piek op 309 nm vertegenwoordigd hydroxyl radicalen (pijl in Figuur 3A). In vergelijking met argon gas alleen, de aanwezigheid van stikstof soorten verhoogd met een mengsel van stikstof in de grondstof gas, terwijl de toevoeging van zuurstof of vochtigheid verminderd of verminderd, respectievelijk. Daarentegen was de aanwezigheid van hydroxyl radicalen daalde met zuurstof of stikstof maar aanzienlijk verhoogd als bevochtigde argon werd gebruikt als grondstof gas. Voor plasma behandeling van vloeistoffen, de verdamping veroorzaakt door de argon gas en argon plasma werd bepaald eerste (Figuur 3B). Nog belangrijker is, opbrengst beide voorwaarden niet vergelijkbare resultaten omdat plasma ook effecten op temperatuur oefent. In overeenstemming met de resultaten van de OES van hydroxyl radicalen, waterstofperoxide afzetting aanzienlijk daalde met zuurstof of stikstof vermenging maar verhoogd met bevochtigde grondstof gas (Figuur 3C). Bovendien, de toevoeging van stikstof aan de grondstof gas geleid tot aanzienlijk hogere concentraties van nitriet in vergelijking met argon plasma-behandelde vloeistoffen (Figuur 3D). Deze werkstroom kan ook worden aangewend om te onderzoeken van het effect van plasma op vloeistoffen met verschillende composities. Bijvoorbeeld, leek waterstofperoxide concentraties te zijn onafhankelijk van de aanwezigheid van foetaal kalfsserum in PBS en RPMI1640 cel kweekmedium (Figuur 3E). De aanwezigheid van serum daalde in de dezelfde monsters, nitriet concentratie in PBS en cel kweekmedium in vergelijking met hun niet-serum met tegenhangers (Figuur 3F). Meeste superoxide werd geproduceerd in de droge argon gas voorwaarden met zuurstof en/of stikstof betonsamenstelling aanzienlijk blussen superoxide generatie, met uitzondering van de bevochtigde argon-zuurstof plasma (Figuur 3G). Voor plasma behandeling van cellen in meerdere goed gerechten, de plaat met cellen eergisteren ontpit was verwijderd uit de incubator en toegevoegd aan de kunststof houder. Het patroon van een geprogrammeerde behandeling werd toegepast, werd gecompenseerd door verdamping en de plaat stond weer in de incubator voor 20 h. opmerking dat na deze incubatie, cel cultuur supernatant kon zijn verzameld in een nieuwe, lege 96-wells-plaat en opgeslagen bij- 80 ° C voor de beoordeling van proteïnen van belang. Resazurin is vervolgens de cellen van elk putje toegevoegd. Omzet van niet-belichting fluorescerende resazurin aan fluorescerende resorufin alleen werd vergemakkelijkt door actieve NADPH genererende enzymen en was gecorreleerd met algemene metabole activiteit (Figuur 4A). Intensiteit van de fluorescentie vergelijkbaar waren met de visuele perceptie van de plaat en cytotoxische effecten van langdurige plasma behandeling (Figuur 4B) aangegeven. Bevochtigde gas voorwaarden waren schadelijker dan droog gas voorwaarden. Dezelfde cellen in de plaat werden gebruikt voor verder stroomafwaarts testen. Cellen in de plaat microscopisch werden onderzocht (Figuur 4C). Met behulp van beeldbewerkingssoftware, werden diverse putjes van de plaat onderzocht voor kwalitatieve vergelijking (Figuur 4D). Software kon de kwantificering van de totale oppervlakte vallende cellen binnen het gezichtsveld verworven in elk putje en de resulterende gegevens werden genormaliseerd naar respectieve controles (Figuur 4E). Een daling van de cel totaal gebied werd gezien in de plasma behandeling monsters, vooral met de bevochtigde grondstof gas-voorwaarden. Na imaging, werden de cellen gewassen, gekleurd met anti-muis calreticulin antilichamen, vrijstaand en geanalyseerd met stroom cytometry (Figuur 4F). Fluorescentie intensiteiten van calreticulin vlekken in levensvatbare cellen (Figuur 4G) werden berekend en vergeleken tussen de monsters (Figuur 4H) betekenen. Plasma behandeling geïnduceerde een opregulatie van calreticulin op het celoppervlak lymfkliertest melanoom, die overeenkwam met de plasma behandeltijd met droge grondstof gas voorwaarden toegepast. Voor bevochtigde grondstof gas voorwaarden, 20 s en 40 s van behandeling geïnduceerde een sterkere blootstelling van de calreticulin ten opzichte van de dodelijker 60 s behandeltijd. Dit suggereert dat er was een niet-lineaire regulering van calreticulin blootstelling met betrekking tot de hoeveelheid oxidanten ingevoerd om de cellen. Figuur 1 : Workflow van medisch onderzoek van plasma uit de natuurkunde naar de biologie. De reactieve soorten output van de atmosferische druk argon plasma jet is afgestemd door het moduleren van de grondstof gas. Geselecteerde moleculen in de gasfase plasma worden gecontroleerd met behulp van spectroscopie. Het plasma wordt gebruikt voor het behandelen van vloeistoffen en onderzoeken oxidant afzetting. Cellen gekweekt in microplates zijn plasma-behandeld, en biologische uitlezingen worden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : Installatie van de plasma onderzoek Bank. (A) verschillende gassen in roestvrij stalen buizen in verschillende massastroom controllers die worden beheerd via een centrale paneel zijn gedreven. De individuele feed gassamenstelling is gemengd daarna met behulp van een panel van kleppen. (B) sommige reactieve componenten van het plasma kunnen worden gecontroleerd met behulp van optische emissie spectroscopie te onderzoeken van de verschillen tussen de verschillende samenstellingen van de grondstof gas. (C) voor de plasma high-throughput onderzoek, 96-Wells-microplates worden gebruikt. Om ervoor te zorgen een constante vertrekpunt voor programmeerbare en geautomatiseerde plasma behandeling, wordt de plaat toegevoegd aan een frame garanderen van de dezelfde absolute positie van platen van dag tot dag. (D) de plasma-jet is bevestigd aan een computergestuurde xyz-tabel bevindt zich onder de motorkap van een laminaire flow. Alle 96 exacte locaties en de nadruktijd van het plasma over elk is goed geschreven in een programmabestand te begeleiden van het verkeer van de plasma-bron. De belangrijkste behuizing van het apparaat plasma straal evenals de motor besturingselementen bevinden zich in de nabijheid. (E) geautomatiseerd plasma behandeling van een 96-wells-plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Plasma jet en vloeistof analyse. (A) optische spectroscopie van de emissie van verschillende grondstof gas voorwaarden wordt weergegeven. Het tweede positieve systeem van stikstof (330 nm tot en met 380 nm) werd verhoogd met vermenging van stikstof, afwezig bij de vermenging van zuurstof, en aanzienlijk verminderd met bevochtigde argon (links panelen). Het hoogtepunt van de hydroxyl radicalen op 309 nm (pijl) daalde in stikstof en zuurstof voorwaarden maar aanzienlijk verhoogd met bevochtigde argon in vergelijking met argon gas alleen. (B) Gas blootstelling van vloeistoffen tot verdamping leidt. Het bedrag van verdamping per putje in een plaat van de 96well op een behandeling met plasma en argon gas alleen werd bepaald door weging van de plaat voor en na behandeling met behulp van een mooie schaal. Verdamping in monsters van plasmatreated was hoger in vergelijking met die in argon gastreated monsters. (C) generatie van waterstofperoxide in plasmatreated vloeistoffen gecorreleerd tot op zekere hoogte met de 309 nm piek van hydroxyl radicalen in (A). Bevochtigde (5%) argon plasma verhoogd peroxide concentraties ongeveer 4fold. (D) nitriet werd verheven als stikstof werd toegevoegd aan de grondstof gas, en dit effect werd verhoogd met bevochtigde argon plasma. De toevoeging van zuurstof daalde nitriet generatie maar niet significant. (E, F) Waterstof peroxide en nitriet concentraties wordt weergegeven in verschillende soorten vloeistoffen, namelijk RPMI1640 cel kweekmedium met (R10F) en zonder (R0F) en PBS met en zonder foetaal kalfsserum (FCS). Peroxide niveau niet verschillen tussen verschillende media (E) Overwegende dat nitriet niveaus werden aanzienlijk verlaagd in aanwezigheid van serum. (G) Superoxide productie was het hoogst voor droge argon gas feed gas; vermenging van stikstof, zuurstof of bevochtigde argon gaf lagere superoxide afzetting in de vloeistof. Gegevensset die wordt getoond (B-G) zijn de gemiddelde + SEM van twee tot drie experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd (C, D) met behulp van one-way variantie-analyse vergelijken hele groep middelen van droge of vochtige grondstof gas voorwaarden tegen de respectieve controle (** p < 0,01; *** p < 0,001). Bovendien, argon gas-alleen plasma voorwaarden werden vergeleken met behulp van het gemiddelde van de hele groep en de t-test (### p < 0,001). Verdere statistische analyse (F) werd uitgevoerd met behulp van de t-testen vergelijken de waarden van elke plasma behandeling en middellange voorwaarde in de monsters met FCS en zonder FCS (* p < 0.05; ** p < 0.01); ook FCS of niet-FCS waarin oplossingen werden vergeleken binnen elke plasma behandeling tijd met behulp van de t-test (# p < 0.05; ## p < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Plasma behandeling en het effect ervan op cellen. (A) cellen werden blootgesteld aan plasma en resazurin was toegevoegd na 20u te beoordelen van de metabole activiteit. (B) activiteit werd aanzienlijk verlaagd in plasmatreated monsters in vergelijking met gas besturingselementen. Een duidelijke daling werd gezien met bevochtiging van de grondstof gas, overwegende dat de toevoeging van zuurstof en/of stikstof leidt tot toxiciteit in zowel droge en vochtige argon gas voorwaarden. (C) opslagmedium met propidium jodide (PI) is toegevoegd. (D) een overzicht wordt weergegeven van de putjes van de plaat met digitale fase contrast (oranje) vertegenwoordigen de cytosolische Fractie van elke cel en de PI (groen) dode cellen worden geïdentificeerd. Imaging tools toegestaan het kwantificeren van de totale oppervlakte binnen het gezichtsveld van elk goed bedekt met cellen. (F) cellen werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met antilichamen of andere markeringen van de cel te karakteriseren van biologische plasma effecten met behulp van stroom cytometry. (G) Gating strategieën werkten en marker analyse werd uitgevoerd en vergeleken tussen de monsters. Gegevens (B, E, H) worden weergegeven, duiden de gemiddelde + SEM uit één vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten. Schaal bar = 200 µm (D). Statistische vergelijking werd uitgevoerd met behulp van twee richtingen analyse van varianties (B, H) vergelijken, voor elke voorwaarde die gas, elke plasma behandeling aan de respectieve gasbeheersing (* p < 0.05; ** p < 0,01; *** p < 0,001). Bovendien, de waarden voor elke voorwaarde van stikstof en/of zuurstof betonsamenstelling werden vergeleken met de waarden van argon gasplasma voor droge en vochtige omstandigheden afzonderlijk (twee richtingen analyse van varianties; ### p < 0,001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Fundamenteel onderzoek is van fundamenteel belang voor de ontwikkeling van een goed begrip van de werkzaamheid van en mechanismen onderbouwing plasma geneeskunde in preklinisch en klinisch onderzoek. Fundamenteel onderzoek bevordert ook het onderzoek naar nieuwe toepassingen voor behandelingen. Terwijl het is reeds lang gevestigd dat plasma’s hun biologische effecten via generatie van reactieve zuurstof en stikstof soorten19 bemiddelen, zijn er nog drie belangrijkste uitdagingen voor het veld. Ten eerste, welke soorten zijn belangrijk? Dit kan deels worden beantwoord door het moduleren van de grondstof gassamenstelling van plasma’s met optische diagnostiek en biologische uitlezingen. 20 tweede, wat effecten kan worden gezien in de biologische doelen zoals cellen? Dit wordt, op zijn minst gedeeltelijk, behandeld met behulp van cel cultuur experimenten en een aantal testen. In eukaryote cellen, effecten zijn pleiotropic inclusief celcyclus arrestatie21, apoptosis22, necrose23, en huid cel stimulatie24,25,26, evenals een ondersteuning of daling van de cel motility of metabole activiteit27,28,29. De derde uitdaging, met betrekking tot deze pleiotropic effecten, is het identificeren van sleutelmoleculen die bepalend zijn voor de cellulaire reactie op plasma bereide oxidanten uit te leggen van de verschillende effecten vaak gezien in verschillende soorten cellen. Dit kan gedaan worden door omics technieken30,31,32 en/of omhoog of Downregulatie van doelgenen met behulp van siRNA (redox) signalering-remmers, anti-oxidanten en antioxidant enzymen, evenals de modulatie van de plasma van reactieve soorten uitvoer. 33 , 34 , 35 daarom, gestroomlijnde assay protocollen nodig zijn om te testen van grotere sample sets met groot aantal iteraties.

Deze studie is een voorbeeld van een efficiënte workflow van experimentele, uit de natuurkunde naar de biologie, voor plasma medisch onderzoek met betrekking tot de bovengenoemde uitdagingen. Details over de technische aspecten van de bron van de plasma en het plasma generatie zijn vóór beschreven. 36 , 37 , 38 worden alle van deze tests uitgevoerd in 96well platen, die heeft een aantal voordelen. Bijvoorbeeld, kunnen monsters zoals cel cultuur supernatant gemakkelijk gebeuren van assay aan collectie platen te onderzoeken, bijvoorbeeld eiwit concentraties via de enzym-verbonden-immunosorbent-analyse. Als wetenschappelijk materiaal staat lezing rechtstreeks van 96-wells beschikbaar is, wordt een dergelijke aanpak minimaliseert kost per monster en handsontime en maximaliseert resultaten door multiplexing van verschillende tests van hetzelfde monster. Het gebruik van meerkanaals pipettes Bovendien versnelt monster behandeling. In principe, kan de hier beschreven test ook worden uitgevoerd met behulp goed plaat formaten met grotere goed diameters, hoewel dit extra pipetting stappen in andere buizen en schepen voor downstream testen vereisen zou. Kleinere plaat typen zoals 384well platen, vertonen echter niet de geometrie geschikt voor onderzoek van de biomedische plasma jets met grote grondstof gas fluxen. In het bijzonder kan niet worden gegarandeerd dat alleen één maar niet aangrenzende putten tijdens een behandeling ondervinden.

Vloeibare analyse is essentieel om te onderzoeken diersoorten afzetting door het plasma. In de analyses van deskundigen, kan een parallelle installatie van verschillende tests plasmatreated vloeistoffen met betrekking tot verschillende oxidanten karakteriseren op hetzelfde moment. Deze multiplexing biedt voor de ontwikkeling van een gedifferentieerde beeld van plasmaderived soorten. De beschreven aanpak is zeer gevoelig voor het onderzoeken van waterstofperoxide concentraties39, die is vaak noodzakelijk, maar niet altijd voldoende om uit te leggen van plasma effecten. 40 , 41 , 42 biologisch relevante effecten kunnen ook worden beoordeeld, in vloeistoffen met een test van de glutathion hier niet inbegrepen. 43 de bepaling van specifieke nitriet wordt sterk aangeraden boven conventionele Griess-Assays als gevolg van de 10fold hogere gevoeligheid van de test (gegevens niet worden weergegeven). Plasmatreated vloeistoffen kunnen ook worden onderzocht voor de vorming van waterstofhypochloriet zuur met behulp van de DTNB-bepaling. Vorige resultaten deed echter niet geven aan de vorming van die soort met onze plasma-bron. 19 , 39 , 44 nadat plasma behandeling is voltooid, de verslechtering van de soort plaatsvindt na verloop van tijd. Nitriet reageert op nitraten; peroxide is ook verbruikt na verloop van tijd. Deze processen worden echter enkele uren duren. 35 cytochroom c absorptie is stabiel over enkele uren ook. Daarom, als processen zich voordoen binnen de eerste 30 min na de behandeling, variatie in concentraties langlevende soorten die hier worden beschreven zijn te verwaarlozen. Echter zorg moet worden genomen wanneer bepaalde soorten media (bijvoorbeeldde Dulbecco bewerkt Eagle Medium) onderzoeken als ingrediënten opruimen kan omhoog aan 90% peroxide binnen 1 uur (gegevens niet worden weergegeven) leiden tot een onderschatting van plasma peroxide afzetting in vloeistoffen.

Een multiplex assay wordt gepresenteerd die varieert van de metabole activiteit onderzoeken over cel gebied (morfologie) op cel oppervlakte marker expressie. Een combinatie van deze tests kan onthullen interessante resultaten. Bijvoorbeeld, hebben wij eerder in THP1 monocyten getoond dat metabole activiteit en cel graven niet op een lineaire wijze na blootstelling aan plasma doen afnemen. 45 Rather, met toenemende plasma behandeltijd, cellen werden waargenomen die groter waren geworden en had een hogere mitochondriale massa, waardoor hogere stofwisseling op basis van de percell. In wezen, de combinatie van multiplate lezer, microscopie en stroom cytometry multiplexes informatie over cellulaire reacties na plasma behandeling. In melanoom cellen focussen we hier op cytotoxische effecten en hun immunogeniciteit gemedieerd door calreticulin. 46 in principe vele andere vragen kunnen worden aangepakt met deze aanpak metabole activiteit met beeldvorming en stroom cytometry resultaten te koppelen. Bijvoorbeeld, kan celdifferentiatie (bijvoorbeeld macrofaag polarisatie), Mitochondriale membraanpotentiaal, celcyclus analyse, de beweeglijkheid van de cel, biomechanica of micronucleustest vorming voor analyse van genotoxiciteit ook worden onderzocht in Plasma-behandelde cellen. Multicolor stroom cytometry zorgt voor nog meer toepassingen in verschillende cel populaties op hetzelfde moment. Dit omvat bijvoorbeeld de analyse van de status van de fosforylatie van signalering eiwitten zoals transcriptiefactoren, mRNA kwantificering, meting van intracellulaire cytokinen, en/of beoordeling van totale verminderde thiolen op het niveau van een enkele cel. Extra biologisch relevante informatie die beschikbaar is voor elk monster helpt bij de verdere ontwikkeling van het beeld van plasma redox effecten om huidige en toekomstige plasma toepassingen beter te begrijpen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiering van het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd verlenen nummers 03Z22DN11 en 03Z22DN12) dankbaar wordt erkend.

Materials

accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -. D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen – A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins–molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -. D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -. D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).

Tags

Plasma MedicineMulti-well AssayOptical Emissions SpectroscopyLiquid AnalysisCellular ActivityMicroscopyFlow CytometryPlasma-derived Reactive SpeciesImmunogenic Cancer Cell DeathSemi-automated Approach96-well PlatePlasma JetSuperoxide AnalysisCell Metabolic ResponseResazurin Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine – A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image