JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

מחקר בסיסי ברפואה פלזמה - הגישה של תפוקה של נוזלים תאים

Published: November 17, 2017
doi:
10.3791/56331
, , , , ,
1ZIK plasmatis,Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology

Summary

פרוטוקול הטיפול פלזמה הפיזי קר תפוקה גבוהה של נוזלים ותאים מוצג. זה כרוך בהגדרת גז הזנה שונים יצירות להצתה פלזמה, מדידת ספקטרום הפליטה של הפלזמה, וניתוח עוקבות של נוזלים ופעילות הסלולר לאחר טיפול פלזמה.

Abstract

ברפואה פלזמה מיוננת גזים עם טמפרטורות של חוליות מערכות יוחלו על תאים ורקמות. פלזמות קר הפקת ונבדקים מינים ידועים כדי חמצון-חיזור לווסת תהליכים ביולוגיים על בריאות ומחלה. ניסויים פרה-קליניים ומחקרים קליניים הראיות מצביעות על השפעות מועילות הטיפול פלזמה ריפוי של כיב כרוני של העור. נושאים המתעוררים אחרים, כגון טיפול בסרטן פלזמה, מקבלים תשומת לב גדלה והולכת. המחקר הרפואי פלזמה דורש מומחיות הבינתחומי פיזיקה, כימיה, או שילובם. מטרה אחת של פלזמה המחקר היא לאפיין תאים פלזמה שטופלו במגוון יישומים ספציפיים. אלה כוללים, לדוגמה, ספירת תאים, הכדאיות, הסלולר חמצון, פעילות מיטוכונדריאלי, cytotoxicity, מצב של מוות של תאים, ניתוח מחזור התא, התא סמן משטח ביטוי ושחרור ציטוקינים. מחקר זה מתאר את ציוד חיוני ואת זרימות העבודה הדרושות עבור מחקר כזה ב פלזמה וההתערבות. הוא מתאר את הפעילות התקינה של הלחץ האטמוספרי ארגון פלזמה סילון, במיוחד פיקוח על ספקטרום הפליטה בסיסי שלו. ולהאכיל גז הגדרות כדי לווסת את תגובתי מינים פלט. באמצעות אפליקציית xyz-טבלה תוכנות מחשב, המטוס היא רכנה בתוך אלפיות השניה דיוק החללים של הצלחות 96-ובכן מיקרומטר דיוק עבור הפארמצבטית מקסימלי. מבחני במורד הזרם לניתוח נוזלי של חמצון-חיזור-פעיל מולקולות מוצגים, התאים היעד שטופלו פלזמה. באופן ספציפי, בתאי מלנומה מנותחים ברצף יעיל של מבחני עוקבים אחר אלא באמצעות לאותם התאים: מדידה של פעילות חילוף החומרים בתא סכום באזור, סמן משטח הביטוי של calreticulin, מולקולה חשובה מוות של תאים immunogenic של תאים סרטניים. אלה מבחני לאחזר מידע ביולוגי עשיר בתוכן אודות אפקטים פלזמה מצלחת אחת. כליל, מחקר זה מתאר את השלבים החיוניים ואת פרוטוקולים למחקר רפואי פלזמה.

Introduction

תגובתי מינים הם חשובים חמצון-חיזור הרגולטורים במחלה, כולל ריפוי1 וסרטן הפצע לא נורמלי. 2 . חשוב, המינים הללו מעורבים הפתולוגיה, כמו גם את הרזולוציה טיפולית שלה. 3 , 4 קר פלזמה הפיזי הוא גז מיונן אשר גירש מינים תגובתי מסוגים שונים. 5 מאז כניסתו של פלזמות קר כביכול פועלות טמפרטורת הגוף6, פלזמות קר ניתן ליישם תאים ורקמות ללא נזק תרמי. על ידי הפגנת את היעילות ואת היישום בטוח של התקנים פלזמה תצפיות וקליני, שלושה קיבלו הסמכה כמו מכשירים רפואיים בגרמניה. 7 במיוחד בכל הנוגע genotoxic בטיחות, מספר מחקרים הראו העדר מוטגניות אירועים באמצעות המכשיר הראשון, סילון פלזמה ארגון לחץ אטמוספירי. 8 , 9 , 10 שני ההתקנים האחרים הם מכשול מבודד שנקרא הפרשות (DBD), אשר פועלים באמצעות עיקרון שונה מאשר פלזמה סילון. באופן ספציפי, מטוסי לאפשר לטיפול דמויי אזמל של משטחים וחללים ואילו DBD פלזמות יעילים בטיפול אזורי רקמות גדול אך שטוח למדי. ניצול הסלולר חמצון-חיזור איתות11, המטרה של הטכניקה היא לנצל את הנוצרים על-ידי פלזמה מינים תגובתי ביו יישומים. 12 יישום מבטיח במיוחד בטיפול קליני פלזמה היא התמיכה של ריפוי הפצע. 13 , 14 , 15 יתר על כן, פלזמה הוצגה יש תופעות נגד סרטן במודלים של בעלי חיים. 16 , 17 , 18

לפני מאמת את היעילות והבטיחות של יישומים פלזמה בבעלי חיים, או אפילו בני אדם, סטנדרטית במבחנה מחקר צריך להתבצע עם התקנים פלזמה. ניסויים אלה חיוניים כדי לחקור יישומים פלזמה וכדי ניסחו את מנגנוני בעבודה. יתר על כן, מחקר בסיסי יש צורך להבין את ההשפעה של ההרכב של מינים תגובתי ואת השפעות ביולוגיות עוקבות. מחקר זה מדגים איך פלזמה ניתן לשלב המחקר הביו-רפואי כדאי להבין ולשלוט השפעותיו על תאים. הוא מתאר כוונון של גז הזנה קומפוזיציה, ניטור של מינים תגובתי פלט, יישומים של פלסמה נוזלים, תאים, רקמות, ואת התוצאה הנובעת כימיים וביולוגיים. יתר על כן, דוגמאות ניתנים אשר להורות על סטנדרטיזציה של טיפול פלזמה, מבחני ביולוגי במורד הזרם, תוך שימת דגש על מחקר רפואי פלזמה לעשות צלחות 96-ובכן. גישה זו יש יתרונות ברורים: אני) להמעיט ככל האפשר מספר התאים זקוקים לכל תנאי, ריאגנט עלויות, הפעם תרגולים לדגימה; ii) הקצבה של דיוק רב יותר של תוצאות כמו טיפולים כפולים או triplicate ניתן להגדיר בקלות; ו- iii) ההנחיה של assaying במורד חלקה את הקוראים צלחת 96-ובכן עיצוב, הדמיה, ניסויים cytometry זרימה.

Protocol

1. פלזמה מינים ניטור וההתקנה טיפול פלזמה מינים ניטור השתמש סילון פלזמה של הלחץ האטמוספרי ולהאכיל לכל היותר שני רגיל ליטרים לדקה שטף גז. בניצב לציר תימרת, מקם את המטוס לפני ספקטרופוטומטרים פליטה אופטי, photoemission שיא ושימוש אורך הגל (200-1, 000 ננומטר) מוקדש תוכנה. מערבבים 0.5% חנקן או חמצן גז הזנה (5%) או יבש או humidified. חזור על ספקטרוסקופית פליטה אופטי עבור כל תנאי גז. ניתוח עם התוכנה המתאימה עבור תצוגה גרפית של הנתונים. הגדרת טיפול פלזמה לתקן את מטוס מונחה מחשב xyz-לטבלה. לזהות את המיקום של הבארות וצור קובץ script במחשב כדי להזיז את מטוס הצטרף אל השולחן, עם הזמן הטיפול המתאים, מעל המרכז של כל טוב. להוסיף 104 מכל סוג של בתרבית של תאים חסיד ב 100 µL תא מלאה תרבות בינוני (RPMI1640 עם 10% FCS, גלוטמין 2%-1% פניצילין/סטרפטומיצין) לתוך כמה בארות תחת תא למינארי. לאפשר אדהזיה הסלולר להתרחש בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% פחמן דו-חמצני. לטיפול תאי עם פלזמה 20 s בגבהים שונים (ציר z) במרווחי זמן 250 מיקרומטר. להוסיף 25 µL של יודיד propidium תא תרבות בינוני כל טוב. תמונת התאים במיקרוסקופ כדי לקבוע את גובה מסוים זה לא לגרום תא נמק עקב ההזנה גז דוחף המדיום תרבות על גבי התאים הצידה.הערה: עבור שעות טיפול ארוך יותר, לזהות אידוי נוזלים בגובה המסוים הזה, בפלסמה מצב, וביטול ידי שקילה את הצלחת לפני ואחרי טיפול פלזמה כדי לזהות את כמות microliters של מים doubledistilled צורך לחדש osmotic הומאוסטזיס הבארות שטופלו. להתכונן פרוטוקול הסופי xyz-הטבלה עם הטיפול המתאימים (כאן: 20 s, 40 s, s 60 פלזמה ובקרה 60 s גז) טוב עמדות, ואת מוכנה פיפטות רב-ערוצי, מאגרים עבור טיפול בנוזלים של 96-ובכן צלחות במבחני עוקבות. 2. ניתוח של רכיבים עיקריים תגובתי נוזלים שטופלו פלזמה ניתוח של חמצן שטופלו פלזמה לטפל µL 100 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם פלזמה שהפקידים ב שטוח התחתונה 96-ובכן צלחות. להכין תערובת בסיס על ידי העמסת 100 µL ל- PBS עם 10 U של חזרת peroxidase ו 5 מיקרומטר של ריאגנט לזיהוי מימן על-חמצני (מספיק אחד טוב; בהתאם מידה). להוסיף µL 95 של מיקס מאסטר כל טוב.הערה: השלב הקודם צריכה להתבצע תחת הספסל נקי או בחדר נפרד מזה של המקור פלזמה כמו אויר האוזון יכול להפחית את הרגישות של וזמינותו. בצלחת נפרדת, להכין סדרה כפולה דילול של מימן על-חמצני ב- PBS עם ריכוז העליון של 100 מיקרומטר ב- 100 µL PBS. להוסיף 5 µL של דוגמאות או מימן על-חמצני סטנדרטים בארות המכיל את ריאגנט לזיהוי. נמנים בארות המכיל ריאגנט לזיהוי רק עבור רקע חיסור לאחר read-out. דגירה את הצלחת בחושך למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מקם את הצלחת לקורא microplate מדידת קרינה פלואורסצנטית λex 535 nm ו λem 590 ננומטר.הערה: אם ריכוז חמצן גבוה צפויים הדגימות, דילול המדגם צריך להיות מוגברת או קריאות צריך להיעשות עם זמנים קצרים יותר הדגירה כדי להימנע הרוויה של וזמינותו. חיסור ערכים ריקים של כל הדגימות, לחשב עקומת תקן חמצן, לכמת ריכוזי חמצן מדגם לא ידוע מן העיקול הזה בסיסית. ניתוח של פלזמה שטופלו חנקיתי לטפל µL 100 ל- PBS עם פלזמה שהפקידים בתוך צלחות flatbottom 96well. להכין תערובת הבסיס של חנקיתי זיהוי פתרון על-ידי הוספת 1 µL של כימות ריאגנט µL 99 של doubledistilled מים (מספיק אחד טוב; בהתאם מידה). להוסיף µL 100 לכל טוב צלחת ברור, flatbottom 96well. קנה המידה של נדרש עבור מספר בארות. להכין סדרה דילול של סטנדרטים חנקיתי במים doubledistilled. להוסיף 10 µL של תקנים או דגימות לתערובת מאסטר בצלחות 96well. דגירה את הצלחת בחושך למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף 5 µL חנקיתי כימות מפתח בפתרון כל טוב. קרא זריחה בקורא microplate-λex 365 nm ו λem 450 ננומטר. חיסור ערכים ריקים של כל הדגימות, לחשב עקומת סטנדרטי חנקיתי, לכמת מדגם לא ידוע ריכוזים חנקיתי מן העיקול הזה בסיסית. ניתוח של סופראוקסיד שטופלו פלזמה להפוך את תערובת הבסיס של ציטוכרום מחמצנים (1 מ”ג/מ”ל), קטלאז (20 µg/mL) ב- PBS. להוסיף 100 µL של מיקס מאסטר הבארות של צלחת 96-ובכן ברור, שטוח התחתונה. פנקו את מיקס מאסטר עם פלזמה שהפקידים לכל תנאי הטיפול. לקרוא את ספיגת ב 550 ננומטר שימוש בקורא microplate; גרף נתונים אלה. לחשב את כמות סופראוקסיד שנוצר באמצעות המקדם טוחנת הכחדה של ציטוכרום C ולאורך נתיב האור של נוזל בתוך הבאר. 3. התגובה הביולוגית של תאים נחשפים פלזמה Read-Out רב-ממדי של תאים שטופלו פלזמה: פעילות חילוף החומרים השתמש תא למינארי על כל הפרוצדורות הבאות. זרע 104 תאים (מלנומה מאתר B16) בינוני תרבות תא µL מלא בתוספת 100 לכל באר שטוח התחתונה 96-ובכן צלחות. לאפשר אדהזיה הסלולר בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של החממה עם 5% פחמן דו-חמצני. באמצעות הטבלה xyz, מתייחסים וולס עם פלזמה או גז לבד על פי ערכה מוגדרת מראש, וכן להוסיף את התאים בחזרה לתוך החממה במשך 20 h.הערה: אם רצונך בכך, תוריד supernatants לאחר 20 h כדי לנתח מוצרים חוץ-תאית; להוסיף 100 µL בינוני טריים לאחר מכן. כדי כל טוב, להוסיף 25 µL של מדיום התרבות התא המכיל 500 resazurin מיקרומטר (מיקרומטר 100 הריכוז הסופי); מכינים משלוש בארות המכיל resazurin לבד תא בינוני תרבות ללא תאים עבור רקע חיסור. תקופת דגירה של h 3 בחממה. קרא זריחה-λex 535 nm ו λ nmem 590, קורא microplate. להחסיר רקע זריחה של כל הדגימות, לנרמל הנתונים לערכי פקד. Read-Out רב-ממדי של תאים שטופלו פלזמה: ניתוח תמונה שימוש לצלחת טוב מ 3.1.7 ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 100 µL תא טריים תרבות בינוני המכיל 1 יודיד propidium µg/mL. לשים את הצלחת תחת מיקרוסקופ עם שלב ממונע לשיקוף כל טוב.הערה: הדמיה פרטים תלויה השאלה ניסיוני; כאן, שימש מטרה X 20 התקן הדמיה גבוהה-תוכן לקרוא 3 x 3 שדות ראייה בבאר בכל ערוץ שדה בהיר, שלב דיגיטליות חדות ערוץ, קרינה פלואורסצנטית (propidium יודיד) ערוץ, ניצול האור המתאימים עירור פליטה מסננים. שימוש תמונה כמותית ניתוח תוכנה כדי לקבוע שטח cytosolic שלב דיגיטלי תמונות חדות של כל שדות ראייה עם תמונה לכל היטב.הערה: לנתח פרמטרים נוספים במידת הצורך, למשל, את מספר התאים קיימא ו/או מתים או מיטוכונדריאלי פעילות באמצעות כתמים ייעודיים. אם משתמש כתמים אחרים ממה שתואר בעבודה זו, ודא כי קרינה פלואורסצנטית כתמים משמש מיקרוסקופ אינם spectrally חופפים עם fluorochromes להשתמש בניסויים cytometry זרימה עוקבות. גרף הנתונים, אם רצונך בכך, בדקו קורלציה עם הערכים שהתקבלו עבור פעילות מטבולית. Read-Out רב-ממדי של תאים שטופלו פלזמה: Flow Cytometry לניתוח זה, שימוש לצלחת טוב מהשלב 3.2.5. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף פעמיים עם µL 200 ל- PBS המכיל סידן ומגנזיום (0.9 מ מ ו- 0.5 מ מ, בהתאמה).הערה: לתקן ו/או permeabilize תאים בשלב זה עבור נוסף ביולוגי הקריאות הבאות לא מכוסה תרומה זו, כגון צביעה של ניתוח תאיים אנטיגן או מחזור התא. כדי כל טוב, להוסיף 50 µL ל- PBS עם סידן ומגנזיום המכיל נוגדנים חד-שבטיים אנטי-העכבר calreticulin 50 ng/mL. תקופת דגירה של 15 דקות בחממה. לשטוף פעמיים עם 200 µL של מלא בתוספת תא תרבות בינוני וזורקים את הנוזל בצלחת. להוסיף 100 µL של פתרון ניתוק התא מכל קידוח ולאחר תקופת דגירה של 20 דקות בחממה. השתמש אחר קבוצת תאים וללא רבב B16 ההשעיה להגדרת זרימת cytometric רכישת פרוטוקול, gating אסטרטגיה, ואת רווחי מתחים של רסיברים צילום. לטעון את הצלחת לתוך cytometer זרימה מצויד של דוגם אוטומטי עבור לוחות 96-ובכן. לרכוש מינימום של 1000 בתאים פארווערטס, לצד פיזור האוכלוסין בדרך כלל מקושר עם התאים קיימא. להשתמש בתוכנה מוקדש לניתוח של cytometry זרימה, .fcs קבצים לשער האוכלוסייה של עניין, ולקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע calreticulin. גרף נתונים, אם רצונך בכך, בדקו קורלציה עם הערכים שהתקבלו עבור התצהיר פעילות, הדמיה, ו/או חמצון מטבולית.

Representative Results

במחקר זה, תהליך עבודה יעיל תוארה למחקר רפואי לתוך ההשפעות של פלזמה. היסודות לגישה הרב תחומית מנוצל כאן מנתח את הפרופיל הבסיסי פליטה אופטי של המטוס פלזמה, המרכיבים העיקריים תגובתית בתוך הנוזל, או התגובות הביולוגי של תאים שטופלו פלזמה (איור 1). לנהל את זרימת עבודה זו, מספר רכיבים של היו נחוצים כדי להגדיר כראוי את המקור פלזמה (איור 2). גזים שונים (כאן בעיקר ארגון חמצן, חנקן) היו מסופקים, נשלט על-ידי מספר בקרי זרימת מסה. לוח מרכזי שימש להתאמת דיגיטלית בקרי זרימת מסה כדי פלקסים גז הזנה קבועה מראש. להניב יצירות גז הזנה ספציפיים, הגזים היו מעורבים פיזית ניצול פאנל של שסתומים, המשלבת גזים של זרימת מסה מספר בקרי (איור 2א). המקור פלזמה שהודלקה ולאחר למסקנות פלזמה הוקם מול USB-ספקטרופוטומטרים (איור 2B) עם טווח אופטי של 200 ננומטר עד 1,000 ננומטר. לטיפול של נוזלים ותאים, זרימת עבודה יעילה תוארה באמצעות לוחות 96-ובכן. מנות רב טוב נערכו במקום באמצעות מסגרת פלסטיק היה קבוע על הבסיס עם הוספות להתאים חורים הדומיננטיות שלה (איור 2C). לכל הארגון הושם תחת תא למינארי (איור 2D). תוכנית התקנה זו כללה טבלת-xyz אשר הוצגה היצירה ידניים של המטוס פלזמה. האלמנטים השליטה המוטורית עשויה להימצא מחוץ לדוכן, אם האחרון יש יציאות כבל גדול מספיק מ ו לטבלה-xyz. חשוב לציין, השולחן היה מבוקר-מחשב, ניתן לתכנת ריחוף המטוס מעל למרכז מכל קידוח בדייקנות מיקרומטר עבור משך הזמן הרצוי. יתר על כן, נקודת ההתחלה (כמו ההתקנה שלנו, ובכן A1) נבחר באופן חופשי (איור 2E). יחד עם בעל לוחית פלסטיק, פעולה זו מותרת לטיפול פלסמה לשחזור עם כל וריאציות יומיומיות הקשורים אך ורק ההתקנה של הניסויים נוזלי ולא ביולוגי. ספקטרוסקופית פליטה אופטי (OES) היה נוהג לעקוב אחרי פסגות נפרדים המקושרים לרכיבים פלזמה תגובתי בתנאים שונים גז הזנה (איור 3א). לדוגמה, המערכת חיובית השני של חנקן עם שיאים של 330 nm 380 nm ייצג חנקן ונבדקים מינים ולאחר הפסגה ב nm ייצג 309 הידרוקסיל רדיקלים (חץ באיור 3א). לעומת גז ארגון לבד, הנוכחות של חנקן מינים גדל עם תערובת של חנקן לתוך הגז הזנה, בעוד התוספת של חמצן או לחות מופחתת או מופחתת, בהתאמה. לעומת זאת, הנוכחות של הידרוקסיל רדיקלים פחתה עם חמצן או חנקן אבל גדל במידה ניכרת אם ארגון humidified שימש גז הזנה. לטיפול פלזמה של נוזלים, נקבע אידוי הנגרמת על ידי גז ארגון ארגון פלזמה הראשון (איור 3ב). חשוב, שני התנאים שלא הניבו תוצאות דומות כי פלזמה גם מפעיל את ההשפעות על הטמפרטורה. בקנה אחד עם התוצאות OES של הידרוקסיל רדיקלים, מימן על-חמצני התצהיר באופן משמעותי פחתה עם תערובת חמצן או חנקן אך מוגבר בגז הזנה humidified (איור 3ג’). יתר על כן, התוספת של חנקן לגז הזנה הובילה ריכוז חנקיתי גבוה באופן משמעותי לעומת ארגון שטופלו פלזמה נוזלים (איור 3ד’). זרימת עבודה זו עשויה גם להיות מועסק כדי לחקור את ההשפעה של פלזמה על נוזלים עם יצירות שונות. לדוגמה, ריכוזי חמצן נראה להיות עצמאי של הנוכחות של עגל עוברית סרום PBS ו RPMI1640 תא תרבות בינוני (איור 3E). הדגימות באותו, הנוכחות של סרום ירד ריכוז חנקיתי PBS ותא בינוני תרבות לעומת עמיתיהם המכיל הלא-סרום (איור 3F). סופראוקסיד רוב הופק בתנאים גז ארגון יבש עם חמצן ו/או חנקן מוספים באופן משמעותי שכבתה דור סופראוקסיד, חוץ פלזמה חמצן ארגון humidified (איור 3G). לטיפול פלזמה של תאים במנות רב טוב, הצלחת תאים המכילים נזרע שלשום היה להסיר מן החממה ויצורפו לאיש בעל פלסטיק. דפוס מתוכנת הטיפול היה מוחל, אידוי היה פיצוי כספי בעבור ו הלוח הונח בחזרה לתוך החממה עבור ה 20 הערה כי לאחר דגירה הזה, supernatants התרבות התא יכול יש נאספו לתוך צלחת 96-ובכן חדשה וריקה ומאוחסנים ב- 80 ° C להערכה של חלבונים עניין. בשלב הבא, resazurin נוספה בתאים של כל טוב. מחזור של פלורסנט שאינן resazurin כדי resorufin פלורסנט היה רק בהנחייתם של אנזימים ליצירת nadph ל פעילים, היתה בקורלציה עם פעילות חילוף החומרים באופן כללי (איור 4א). עוצמות קרינה פלואורסצנטית דומים לאלה התפיסה החזותית של הצלחת, ומצוינות ציטוטוקסיות ההשפעות של טיפול ממושך פלזמה (איור 4B). גז humidified תנאי היו מזיקים יותר מאשר תנאי גז יבש. לאותם התאים בצלחת נוצלו עבור עוד מבחני במורד הזרם. תאים בצלחת היו ברמה המיקרוסקופית חקר (איור 4C). באמצעות תוכנת הדמיה, כמה בארות של הצלחת נבדקו לצורך השוואה איכותית (איור 4D). תוכנה מותר כימות של השטח מכוסה על ידי תאים בתוך הנוף של שדות רכשה היטב כל הנתונים המתקבלים היו מנורמל לפקדים המתאימים (איור 4E). ירידה של התא הכולל אזור נראתה הדגימות טיפול פלזמה, במיוחד עם התנאים גז הזנה humidified. לאחר דימות, התאים היו שטף, מוכתם נוגדנים אנטי עכבר calreticulin, מנותק, ניתח עם cytometry זרימה (איור 4F). זאת אומרת פלורסצנטיות עוצמות של calreticulin מכתים בתאים קיימא (איור 4G) היו מחושבים, בהשוואה בין דגימות (איור 4H). טיפול פלזמה המושרה קולטנים של upregulation של calreticulin על מלנומה מאתר תא השטח, אשר תאמו זמן טיפול פלזמה חלה בתנאים יבשים גז הזנה. עבור humidified גז הזנה תנאים, 20 s ו- 40 s של טיפול המושרה על חשיפה calreticulin חזק יותר בהשוואה לקטלני יותר זמן טיפול ‘ s 60 ‘. הדבר מצביע על היה תקנה ליניארי של חשיפה calreticulin לגבי הכמות של חמצון הציג את התאים. איור 1 : זרימת העבודה של המחקר הרפואי פלזמה מפיזיקה לביולוגיה. הפלט ונבדקים מינים של המטוס פלזמה ארגון לחץ אטמוספירי מכוון על ידי להתכוונן הגז הזנה. המולקולות שנבחרו בשלב גז פלסמה מנוטרים באמצעות ספקטרוסקופיה. הפלזמה משמש לטיפול נוזלים, לחקור את התצהיר חמצון. תאים תרבותי ב microplates שטופלו פלזמה, המפרט ביולוגיות יבוצעו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : כיוונון של הספסל מחקר פלזמה. (א) גזים שונים נירוסטה צינורות מונעים לתוך מספר בקרי זרימת מסה נשלטים באמצעות לוח מרכזי. היצירה גז בודדים הזנה מעורבת לאחר מכן באמצעות פאנל של שסתומים. (B) רכיבים מסוימים תגובתי של הפלזמה ניתן לנטר באמצעות ספקטרוסקופית פליטה אופטי כדי לחקור את ההבדלים בין קומפוזיציות גז הזנה שונות. (ג) למחקר פלזמה תפוקה גבוהה, משמשים microplates 96-ובכן. כדי להבטיח קבוע נקודת טיפול פלזמה לתכנות ואוטומטיים המוצא, הצלחת נוסף מסגרת המבטיח באותה תנוחה מוחלט של צלחות מיום ליום. (ד) המטוס פלזמה קבוע לטבלה מבוקר-מחשב xyz-הממוקמים תחת תא למינארי. כל המיקומים המדויקים 96 ואת הזמן להתעכב של פלזמה מעל כל טוב נכתב לקובץ התוכנית כדי להנחות את התנועה של המקור פלזמה. הדיור המרכזית של המנגנון פלזמה סילון, כמו גם את הפקדים מנוע ממוקמים בסמיכות. (E) אוטומטית טיפול פלזמה של צלחת 96-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : פלזמה סילון של נוזל ניתוח. (א) אופטי ספקטרוסקופית פליטה של תנאים שונים גז הזנה מוצג. המערכת השנייה חיובית של חנקן (330 nm 380 nm) היה גדל עם תערובת של חנקן, נעדר במקרה של תערובת חמצן, והוא מופחת במידה ניכרת עם ארגון humidified (lefthand לוחות). הפסגה של רדיקלים הידרוקסיל-309 nm (חץ) בתנאי חנקן וחמצן אך גדל במידה ניכרת עם ארגון humidified לעומת גז ארגון לבד. גז (B) החשיפה של נוזלים מוביל אידוי. כמות אידוי לכל טוב בצלחת 96well על טיפול בגז פלזמה וארגון לבד נקבע על ידי שקילה את הצלחת לפני ואחרי טיפול באמצעות סרגל בסדר. אידוי בדגימות plasmatreated היה גבוה יותר בהשוואה לזה ארגון gastreated הדגימות. (ג) דור של מימן על-חמצני plasmatreated נוזלים בקורלציה במידה מסוימת עם הפסגה nm 309 של רדיקלים הידרוקסיל (א). Humidified פלזמה ארגון (5%) גדל ריכוז חמצן בערך 4fold. חנקיתי (D) היה גבוהות כאשר חנקן נוספה הגז הזנה, אפקט זה היה גדל עם ארגון humidified פלזמה. התוספת של חמצן חנקיתי דור ירידה אבל לא באופן משמעותי. (E, F) מימן על-חמצני, חנקיתי ריכוזים מוצגים סוגים שונים של נוזלים, כלומר RPMI1640 תא תרבות בינוני עם (R10F) וללא (R0F) כמו גם PBS עם ובלי סרום עגל עוברית (FCS). רמות חמצן לא שונות בין מדיה שונים (E) ואילו רמות חנקיתי ירדו באופן משמעותי נוכחות של סרום. (G) סופראוקסיד ההפקה הייתה הגבוהה ביותר עבור גז ארגון יבש להאכיל גז; תערובת של חנקן, חמצן או ארגון humidified נתן תצהיר סופראוקסיד התחתון בתוך הנוזל. הנתונים המוצגת (B-G) הן ממוצע + SEM של שניים או שלושה ניסויים. ניתוח סטטיסטי שבוצעו (C, D) השתמש בכיוון אחד השונות השוואת כל הקבוצה האמצעים מהתנאים גז הזנה יבש או לח נגד הפקד המתאים (* * p < 0.01; * * * p < 0.001). בנוסף, ארגון פלזמה גז בלבד בתנאים הושוו באמצעות כל הקבוצה וב של-t-test (# # # p < 0.001). עוד ניתוח סטטיסטי (נ) בוצעה באמצעות השוואת הערכים של כל טיפול פלזמה ומצבו בינוני הדגימות עם FCS ובלי FCS t-בדיקות (* p < 0.05; * * p < 0.01); כמו כן, FCS או הלא-FCS המכיל פתרונות הושוו בתוך כל זמן טיפול פלזמה באמצעות t-המבחן (# p < 0.05; # # p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : טיפול פלזמה והשפעתה על תאים. (א) תאים נחשפו פלזמה ו resazurin נוספה לאחר 20 h כדי להעריך את פעילות חילוף החומרים. פעילות (B) היה ירד באופן משמעותי בדגימות plasmatreated לעומת גז שולט. ירידה ניכרת נראתה עם לחות של הגז הזנה ואילו תוספת של חמצן ו/או חנקן שמוביל רעילות שני התנאים גז ארגון לח ויבש. (ג) בינוני המכיל propidium יודיד (PI) נוספה. (ד) סקירה מוצג הבארות של הצלחת עם ניגודיות שלב דיגיטלי (כתום) המייצג את השבר cytosolic של כל תא ו- PI (ירוק) כדי לזהות תאים מתים. דימות כלי מותר לכימות מכלל השטח בתוך שדה הראייה של כל אחד מכוסה עם תאים. (F) התאים היו לאחר מכן שטף, מודגרות עם נוגדנים או סמנים אחרים תא לאפיין אפקטים פלזמה ביולוגי באמצעות cytometry זרימה. (G) אסטרטגיות Gating הועסקו, סמן ניתוח לבצע והשוו בין דגימות. הנתונים המוצגת (B, E, H) מציינות את ממוצע + SEM של נציג אחד של 3 ניסויים עצמאית. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (D). השוואה סטטיסטית בוצעה באמצעות ניתוח דו כיוונית של סטיות (B, H) השוואת, עבור כל תנאי גז, כל טיפול פלזמה שליטתה גז המתאימים (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001). בנוסף, הערכים עבור כל תנאי של מוספים חנקן ו/או חמצן, לעומת ערכים של ארגון פלסמה גז יבש ואני לח. בתנאים בנפרד (ניתוח דו כיוונית של סטיות; # # # p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מחקר בסיסי הוא היסוד לפיתוח הבנה של היעילות של ואת מנגנוני לגורם המרכזי עליו מושתתת הרפואה פלזמה במחקר קליניות. מחקר בסיסי גם מקדם את החקירה של יישומים חדשים עבור טיפולים. בעוד היא מבוססת היטב כי פלזמות לתווך שלהם השפעות ביולוגיות באמצעות הדור של חמצן תגובתי וחנקן מינים19, ישנם עדיין שלושה אתגרים הראשי אל השדה. ראשית, אילו זנים חשובות? זה יכול להיות חלקית נענו על-ידי להתכוונן ההרכב גז הזנה של פלזמות עם המפרט ביולוגי ולכלי אופטי. 20 . שנית, מה אפקטים ניתן לראות מטרות ביולוגיות כגון תאים? זה, לפחות בחלקו, נשלח באמצעות ניסויים התרבות התא, מספר מבחני. התאים האיקריוטים, אפקטים pleiotropic כולל מחזור התא מעצר21, אפופטוזיס22, נמק23, העור תא גירוי24,25,26, וכן תמיכה או ירידה של תא תנועתיות או פעילות חילוף החומרים27,28,29. האתגר השלישי, הנוגעים תופעות pleiotropic אלה, היא לזהות מולקולות מפתח הקובעות את התגובה התאית פלזמה-derived חמצון להסביר תופעות שונות לעיתים לראות סוגי תאים שונים. ניתן לבצע זאת על-ידי טכנולוגיות טכניקות30,31,32 ו/או למעלה או downregulation של גנים היעד באמצעות siRNA (חמצון-חיזור) איתות מעכבי, נוגדי חמצון, אנזימים נוגדי חמצון, כמו גם אפנון של פלט ונבדקים מינים של פלזמה. 33 , 34 , 35 . לפיכך, פרוטוקולים assay מפושטת נדרשים לבחון קבוצות גדולות דוגמת עם מספר גדול של איטראציות.

מחקר זה מדגימה זרימת עבודה יעילה ניסיוני, מפיזיקה לביולוגיה, למחקר רפואי פלזמה לגבי האתגרים הנ. פרטים על היבטים הנדסיים של המקור פלזמה, פלזמה דור שתוארו קודם. 36 , 37 , 38 כל מבחני אלה מבוצעות בלוחות 96well, שבו יש מספר יתרונות. למשל, דוגמאות כגון supernatants התרבות התא ניתן בקלות לבצע מן assay ללוחות אוסף כדי לחקור, למשל, ריכוז חלבון באמצעות אנזים-מקושרים-immunosorbent-וזמינותו. אם ציוד מדעי מסוגל לקרוא ישירות מ- 96-ולס זמין, גישה כזו מזעור עלויות handsontime ולדגום ומגדיל את התוצאות על ידי ריבוב מבחני שונים מדגם זהה. השימוש רב-ערוצי סיליקון בנוסף מזרז הדגימה טיפול. בעקרון, וזמינותו המתוארים כאן יכול גם להתבצע באמצעות תבניות צלחת היטב עם קטרים גדולים יותר טוב, אבל זה דורש צעדים pipetting נוספים לתוך צינורות אחרים, כלי עבור מבחני במורד הזרם. סוגי צלחת קטנה יותר כגון לוחות 384well, עם זאת, מציג את הגיאומטריה מתאימים למחקר ביורפואי פלזמה באמצעות מטוסי סילון גז הזנה גדולה פלקסים. באופן ספציפי, זה לא ניתן להבטיח בארות יחיד בלבד אך לא סמוכים מושפעים בעת הטיפול.

לאנליזה חיוני לחקור. את התצהיר מינים על ידי הפלזמה. מומחה בניתוח, כיוונון מקבילים של מבחני שונות ניתן לאפיין plasmatreated נוזלים ביחס חמצון שונים באותו הזמן. ריבוב זו מאפשרת פיתוח תמונה הבדיל של מינים plasmaderived. הגישה המתוארת היא רגישה מאוד לחקור את ריכוזי חמצן39, אשר לעתים קרובות הכרחי אך לא תמיד מספיק להסביר אפקטים פלזמה. 40 , 41 , 42 תופעות ביולוגית רלוונטי יכול גם להיות מוערך נוזלים עם וזמינותו גלוטתיון אינם כלולים כאן. 43 וזמינותו חנקיתי ספציפי מומלץ מאוד על-קונבנציונאלי Griess-מבחני עקב רגישות assay גבוהה יותר 10fold (נתונים לא מוצג). Plasmatreated נוזלים יכול ייחקרו גם להיווצרות חומצה hypochlorous באמצעות DTNB-וזמינותו. ובכל זאת, תוצאות קודמות אינן מצביעות על היווצרות של הזן עם המקור פלזמה שלנו. 19 , 39 , 44 לאחר סיום טיפול פלזמה, הידרדרות מינים מתקיים לאורך זמן. חנקיתי מגיב חנקה; כמו כן, מי חמצן הוא נצרך לאורך זמן. עם זאת, תהליכים אלה לארוך מספר שעות. 35 ציטוכרום c הקליטה יציב במשך כמה שעות גם כן. לכן, אם תהליכים מתרחשים במרחק 30 דקות הראשונות לאחר הטיפול, וריאציה בריכוזים של מינים חיים ארוכים המתוארים כאן הם זניחים. עם זאת, יש לנקוט כאשר חוקרים סוגים מסוימים של מדיה (למשל, ששינה נשר בינוני של Dulbecco) כמצרכים יכול ניקוי עד כדי 90% מי חמצן בתוך 1 h (נתונים לא מוצג) המוביל underestimation של פלזמה התצהיר חמצן לתוך נוזלים.

Assay מולטיפלקס מוצג אילו טווחי לחקור פעילות חילוף החומרים על פני שטח התא (מורפולוגיה) לביטוי סמן פני שטח התא. שילוב של מבחני אלה עלול לגלות תוצאות מעניינות. לדוגמה, אנחנו בעבר הראו THP1 ומונוציטים כי ספירת פעילות ותא מטבולית להקטין באופן ליניארי בעקבות חשיפה פלזמה. ראת’ר 45 , עם הגדלת זמן הטיפול פלזמה, תאים נצפו זה היו גדל במידה והייתה מסה מיטוכונדריאלי גבוה יותר, ובכך מוביל גבוה יותר קצב חילוף החומרים שיש על בסיס percell. בעיקרו של דבר, השילוב של הקורא multiplate, מיקרוסקופיה cytometry זרימה האולמות מידע על תגובות הסלולר בעקבות טיפול פלזמה. בתאי מלנומה, אנו כאן מתמקדים ציטוטוקסיות ואפקטים שלהם immunogenicity מתווכת על-ידי calreticulin. 46 . בעיקרון, שאלות רבות נוספות ניתן לטפל עם גישה זו קישור פעילות מטבולית עם תוצאות הדמיה cytometry זרימה. לדוגמה, תאית התמיינות (למשל מקרופאג קיטוב), פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי, ניתוח מחזור התא, התא תנועתיות, ביומכניקה או היווצרות micronucleus לניתוח של genotoxicity יכול גם ייחקרו ב תאים פלזמה שטופלו. Cytometry זרימה ססגוניות מאפשר ליישומים עוד יותר בקרב אוכלוסיות תאים שונים באותו הזמן. זה כולל, לדוגמה, הניתוח של המצב זירחון של איתות חלבונים כגון גורמי שעתוק, כימות mRNA, מדידה של ציטוקינים תאיים, ו/או הערכה של סכום מופחת תיולים ברמה תא בודד. מידע רלוונטי מבחינה ביולוגית נוספים הזמינים עבור כל דגימה מסייע בפיתוח נוסף את התמונה של אפקטים חמצון-חיזור פלזמה כדי להבין טוב יותר יישומים פלזמה הנוכחיים והעתידיים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון גרמניה הפדרלית שר החינוך והמחקר (BMBF הענק מספרים 03Z22DN11 ו- 03Z22DN12) הוא בהכרת תודה הודה.

Materials

accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles’ heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -. D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen – A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins–molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -. D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -. D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).

Tags

Plasma MedicineMulti-well AssayOptical Emissions SpectroscopyLiquid AnalysisCellular ActivityMicroscopyFlow CytometryPlasma-derived Reactive SpeciesImmunogenic Cancer Cell DeathSemi-automated Approach96-well PlatePlasma JetSuperoxide AnalysisCell Metabolic ResponseResazurin Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine – A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image