Summary

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Published: November 13, 2017
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Summary

Test für Transposase zugänglichen Chromatin gepaart mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine genomweite Methode zugänglich Chromatin aufzudecken. Dies ist ein Schritt für Schritt ATAC-Seq-Protokoll von molekularen bis die abschließende computergestützte Analyse, optimiert für menschlichen Lymphozyten (Th1/Th2). Dieses Protokoll kann von Wissenschaftlern ohne Vorkenntnisse in Next Generation Sequencing Methoden übernommen werden.

Abstract

Test für Transposase zugänglichen Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine Methode zur Identifizierung von offenen (zugänglich) Regionen des Chromatins. Diese Regionen sind regulatorische DNA-Elemente (z.B., Promotoren, Enhancer, Locus Kontrollregionen, Isolatoren), welche, die Transkription Faktoren binden. Mapping der zugänglichen Chromatin-Landschaft ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Aufdeckung aktive regulatorische Elemente über das Genom. Diese Informationen dienen als eine unvoreingenommene Ansatz für die Entdeckung, das Netz der relevanten Transkriptionsfaktoren und Mechanismen der Chromatinstruktur, die Genprogramme Ausdruck zu regieren. ATAC-Seq ist eine robuste und sensible Alternative zu DNase ich Überempfindlichkeit Analyse gepaart mit Next Generation Sequencing (DNase-Seq) und Formaldehyd-gestützte Isolation der regulatorischen Elemente (Jahrmarkt-Seq) für genomweite Analyse von Chromatin Zugänglichkeit und die Sequenzierung von micrococcal Nuklease-Sensitive Websites (MNase-Seq) Nukleosom Positionierung zu bestimmen. Wir präsentieren Ihnen ein detailliertes ATAC-Seq-Protokoll optimiert für menschliche primäre d.h. CD4 +-Lymphozyten Immunzellen (T-Helfer 1 (Th1) und Th2-Zellen). Dieses umfassende Protokoll beginnt mit Zellernte, dann beschreibt das molekulare Verfahren von Chromatin Tagmentation, Probenvorbereitung für die Sequenzierung der nächsten Generation, und auch Methoden und Überlegungen für die computergestützten Analysen verwendet, um interpretieren Sie die Ergebnisse. Um Zeit und Geld zu sparen, haben wir darüber hinaus eingeführt Qualitätskontrollmaßnahmen zur Bewertung der ATAC-Seq-Bibliothek vor der Sequenzierung. Wichtig ist, erlauben die Grundsätze, die in diesem Protokoll präsentiert seine Anpassung an anderen menschlichen immun- und nicht-immunen Primärzellen und Zell-Linien. Diese Richtlinien werden auch nützlich für Labore die nicht geübt im Umgang mit Next Generation Sequencing-Methoden sind.

Introduction

ATAC-Seq1,2 ist eine robuste Methode, die Ermittlung der regulatorischen3 offene Chromatin Regionen und Nukleosom Positionierung ermöglicht. Diese Information gilt für ableiten, die Lage, die Identität und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren. Die Methode Empfindlichkeit zur Messung der quantitative Abweichungen in Chromatinstruktur ermöglicht die Untersuchung der Aktivität von Chromatin Faktoren, einschließlich Chromatin Remodelers und Modifikatoren sowie die transkriptionelle Aktivität der RNA-Polymerase II1. ATAC-Seq bietet somit einen leistungsstarke und unvoreingenommenen Ansatz für die Entschlüsselung der Mechanismen, die transkriptionelle Regulierung in jeden Zelltyp des Interesses zu regieren. Wir beschreiben die Anpassung der ATAC-Seq an primären menschlichen Th1 und Th2-Zellen.

ATAC-Seq geladen hyperaktiven Tn5 Transposase mit Adaptern für Next Generation Sequencing (NGS) Paare DNA-Fragmentierung mit tagging von DNA mit Adaptern (d.h. der Prozess “Tagmentation”)1. Nach PCR-Amplifikation sind die daraus resultierenden DNA-Bibliotheken bereit für Next Generation Sequencing (Abbildung 1). Die bevorzugte Tagmentation von zugänglich Chromatin wird durch die Analyse der lokalen Bereicherung der ATAC-Seq Sequenzierung liest erkannt.

Die kurze Versuchsdurchführung und Voraussetzung für weniger Ausgangsmaterial, im Vergleich zu anderen Methoden zur Messung von Chromatin Zugänglichkeit und nucleosomal Positionierung z. B. DNase-Seq4und FAIRE Seq5MNase-Seq6, hat die Verwendung von ATAC-Seq in mehrere biologische Systeme, einschließlich menschliche Primärzellen1,7 und klinischen Proben8, sowie Einzeller9, Pflanzen10, Fruchtfliegen11 gefördert , und verschiedene Säugetiere12.

Die Identität der Transkription, die Faktoren, die an zugänglich Loci gebunden sind durch Analyse der Anreicherung von ihrer Bindung Sequenzmotive oder Kombination von ATAC-Seq mit Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (aufgedeckt werden können ChIP-seq). Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Geschlecht-spezifische Transkriptionsfaktoren wichtig für die Blutbildung Maus13. Die unvoreingenommene und globale Natur der ATAC-Seq ermöglicht Studium der Genregulation in Organismen für die Reagenzien wie Antikörper gegen ChIP-Analyse nicht verfügbar sind. Z. B. evolutionäre Variationen in Cis-regulatorische Regionen wurden durch das Studium der kranialen Neuralleiste Zellen von Menschen und Schimpansen14, Entwicklungsstörungen Variationen in regulatorischen Elemente während der frühen Maus Embryogenese15, ändert in der regulatorischen Landschaft während einer Lebensdauer von einzelligen C. Owzarzaki9und die Entwicklung der Promotoren und Enhancer über 20 Säugetier Arten12.

ATAC-Seq war auch maßgeblich für die Messung von Chromatin Barrierefreiheit in Einzelzellen, so aufschlussreich Variabilität innerhalb Zell-Populationen, die in der Regel genomweite Studien7,16entzieht. ATAC-Seq kann darüber hinaus verwendet werden, um Veränderungen zu studieren, die in regulatorischen Regionen der DNA in Erkrankungen, auftreten, in denen Proben selten sind. Z. B. ATAC-Seq kann verwendet werden, um Veränderungen im regulatorischen Umfeld zu studieren, während der Beginn der akuten myeloischen Leukämie (AML)17 oder Ras-Onkogenese11angetrieben.

Protocol

alle Verfahren wurden von institutionellen Review Board der Bar-Ilan-Universität angenommen und das Protokoll folgt den Richtlinien des Ausschusses zur Genehmigung der Experimente zur Verfügung gestellt. 1. Reinigung von naiven CD4 + Zellen und Polarisation zu T-Helfer-1 (Th1) und Th2-Zellen Hinweis: hier beschreiben wir die Vorgehensweise, die gefrorenen menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ab. Der erste Schritt besteht aus CD4 + Zellen mitt…

Representative Results

Das Endergebnis dieses Protokolls ist ein ATAC-Seq-Bibliothek von in der Regel 3-20 ng/µL. Bei der Ausführung auf ein System für die DNA-Integrität-Analyse (siehe Tabelle der Materialien/Geräte), sie zeigen Leiter aussehen2 (Abb. 3A). Die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente ist in der Regel ~ 450-530 bp. Richtige Qualitätskontrolle der ATAC-Seq-…

Discussion

Das hier beschriebene ATAC-Seq-Protokoll erfolgreich eingesetzte für die Analyse von zugänglich Chromatin in primäre Zellen (menschliche Th1, Th2 Zellen und B-Zellen) sowie die kultivierten Zelllinien (MCF10A menschlichen Brustkrebszellen und U261-Glioblastom-Zellen). Andere Zelltypen ATAC-Seq zuweisen kann einige Protokoll-Optimierung, vor allem in der Lyse Schritt erfordern. Wenn die Konzentration von nichtionischen Waschmittel zu hoch ist, liegt möglicherweise ein höherer Prozentsatz der mitochondrialen DNA-Konta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt von der Israel Science Foundation (Grant 748/14), Marie-Curie-Integration gewähren (CIG) – RP7-Menschen-20013-CIG-618763 und -CORE Programm für Planung und Budgetierung Ausschuss und der Israel Science Foundation grant Nr. 41/11.

Materials

50 mL tubes Lumitron LUM-CFT011500-P Can be from other vendors.
Microtubes Axygen Inc MCT-175-C Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes Corning Costar 4489 Can be from other vendors.
Tissue culture flask Lumitron LUM-TCF-012-250-P Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter Invitrogen C10227
NucleoSpin Tissue MACHEREY-NAGEL 740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) ATCC  PCS­800­011 Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium Biological Industries 01-103-1A Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM) Biological Industries 03-020-1B Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin Biological Industries 03-031-1B Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade Biological Industries 04-127-1 Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Anti-Human CD4 FITC Biogems 06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC Biogems 44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3) Tonbo biosciences 40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified Biogems 10311-25
Recombinant Human IL2 Peprotech 200-02
Recombinant Human IL4 Peprotech 200-04
Recombinant Human IL12 p70 Peprotech 200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) Tonbo 40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ BioLegend 506513
NaCl, analytical grade Carlo Erba 479687 Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade Calbiochem 442611 Can be from other vendors.
EDTA MP Biomedicals 800682 Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure MP Biomedicals 819620 Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) Calbiochem 492016 Can be from other vendors.
Protease Inhibitors Sigma P2714 this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads Beckman 63881
PCR purification kit HyLabs EX-GP200 Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) Illumina FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix New England BioLabs M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543
SYBR Green I  Invitrogen S7585
 CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio-rad 185-5200 Can be from other vendors.
CFX Manager Software Bio-rad 1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad 172-5124 Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0 Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
Magnet for eppendorf tubes Invitrogen 12321D Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes Thermo Scientific 75004527 Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker MRC Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5585
4200 TapeStation system Agilent Technologies G2991AA Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626 Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence Company
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TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
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Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
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F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' IDT

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Grbesa, I., Tannenbaum, M., Sarusi-Portuguez, A., Schwartz, M., Hakim, O. Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq. J. Vis. Exp. (129), e56313, doi:10.3791/56313 (2017).

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