Assay для Транспозаза-доступные Chromatin, в сочетании с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) является геном общесистемной методом для выявления доступных хроматина. Это шаг за шагом протокол ATAC-seq, от молекулярных окончательного вычислительной анализу, оптимизированный для лимфоцитов человека (Th1/Th2). Этот протокол может быть принят исследователи без предварительного опыта в методах секвенирование нового поколения.
Assay для Транспозаза-доступны Chromatin с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) — это метод, используемый для идентификации открытых (доступный) регионов хроматина. Эти регионы представляют регуляторных элементов ДНК (например, промоутеров, усилители, локус контроля регионов, изоляторы), в котором транскрипции факторов привязки. Отображение доступных хроматина пейзаж является мощный подход для выявления активных нормативных элементов по всему геному. Эта информация служит беспристрастный подход для обнаружения сети соответствующих транскрипционных факторов и механизмов структуры хроматина, которые управляют программами выражения гена. ATAC-seq является надежной и чувствительных альтернативой DNase I Гиперчувствительность анализ в сочетании с следующего поколения последовательности (DNase-seq) и при содействии формальдегида изоляции регуляторных элементов (Фэр seq) для анализа генома общесистемной хроматина доступность и последовательность Микрококковая Нуклеаза чувствительных участков (MNase-seq) для определения позиционирования нуклеосома. Мы представляем подробную ATAC-seq протокол, оптимизированный для человека первичной иммунной клетки т.е. CD4 + лимфоцитов (Т-хелперами 1 (Th1) и Th2 клетки). Этот всеобъемлющий протокол начинается с клетки урожая, а затем описывает молекулярное процедура tagmentation хроматина, пробоподготовка для виртуализации нового поколения и также включает методы и соображения для вычислений анализа используется для интерпретировать полученные результаты. Кроме того чтобы сэкономить время и деньги, мы ввели меры контроля качества для оценки ATAC-seq библиотеки до последовательности. Важно отметить, что принципы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют его адаптации в другие клетки человека иммунной и неиммунизированных начальных и клеточных линий. Эти руководящие принципы также будут полезны для лабораторий, которые не владеют методами секвенирование нового поколения.
ATAC-seq1,2 — надежный метод, который позволяет идентифицировать регулирования3 открытых хроматина регионов и позиционирования нуклеосома. Эта информация применяется для определения местоположения, личность и активности транскрипционных факторов. Чувствительность метода для измерения количественных различий в структуре хроматина позволяет изучение деятельности хроматина факторов, включая хроматина ремонтом и модификаторов, а также транскрипционный анализ деятельности РНК полимеразой II1. Таким образом ATAC-seq обеспечивает мощный и непредвзятого подхода для расшифровки механизмов, которые регулируют регуляцию в любой тип клеток интереса. Мы описываем адаптации ATAC-seq для первичного Th1 и Th2 клетки человека.
В ATAC-seq гиперактивный Tn5 Транспозаза загружен с переходниками для следующего поколения последовательности (НГС) пары фрагментацию ДНК с разметкой ДНК с адаптеров (т.е., процесс «tagmentation»)1. После амплификации PCR в результате библиотеки ДНК готовы для следующего поколения последовательности (рис. 1). Льготные tagmentation доступных хроматина обнаруживается анализ местного обогащения ATAC-seq последовательность читает.
Короткие экспериментальной процедуры и требования для меньше исходного материала, относительно других методов для измерения доступности хроматина и nucleosomal позиционирования DNase-seq4, Фэр seq5и6MNase-seq имеет поощрять использование ATAC-seq в нескольких биологических систем, включая человеческие клетки первичной1,7 и8клинических образцов, а также одноклеточные организмы9,10растений, плодовых мух11 и различных млекопитающих12.
Личность транскрипции, факторы, которые связаны с доступными локусов можно обнаружили анализ обогащения их мотивы последовательности привязки или сочетаются ATAC-seq chromatin иммунопреципитации (чип) следуют высок объём (секвенирование ДНК ChIP-seq). Этот подход позволил идентификации линии специфических транскрипционных факторов важно для кроветворения в мыши13. Беспристрастной и глобальный характер ATAC-seq позволяет изучение гена регулирование в организмов, для которых реагенты, такие как антитела для анализа чипа не доступны. Например, эволюционные изменения в СНГ-регулирования регионах были определены путем изучения черепной нейронные крест клетки человека и шимпанзе14, развития изменения в регуляторных элементов во время ранних мыши Эмбриогенез15, изменения в нормативно-правовой ландшафт во время жизненного цикла одноклеточными C. owzarzaki9и эволюция промоутеров и усилители через 20 млекопитающих видов12.
ATAC-seq также играет важную роль для измерения доступности хроматина в одиночных клетках, таким образом показывая изменчивость в клеточных популяций, который обычно избегает генома общесистемного исследования7,16. Кроме того ATAC-seq может использоваться для изучения изменений, которые происходят в ДНК нормативных областях в условиях заболевания, в которых образцы редки. К примеру, ATAC-seq может использоваться для изучения изменений в нормативно-правовой ландшафт во время наступления острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)17 или рас-driven онкогенеза11.
ATAC-seq протокол, описанный здесь успешно применяются для анализа доступных хроматина в Главные ячейки (человека Th1, Th2 клетки и клетки B) а также искусственный клеточных линий (MCF10A молочной железы человека раковые клетки и клетки U261 глиобластома). Применение ATAC-seq в другие типы клеток, может…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа поддерживается Фондом науки Израиля (Грант 748/14), Мари Кюри интеграции Грант (CIG) – FP7-люди-20013-сиг-618763 и -CORE программа планирования и составления бюджета Комитет и фонд науки Израиль Грант № 41/11.
50 mL tubes | Lumitron | LUM-CFT011500-P | Can be from other vendors. |
Microtubes | Axygen Inc | MCT-175-C | Can be from other vendors. |
25 mL serological pipettes | Corning Costar | 4489 | Can be from other vendors. |
Tissue culture flask | Lumitron | LUM-TCF-012-250-P | Can be from other vendors. |
Countes Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
NucleoSpin Tissue | MACHEREY-NAGEL | 740952.5 | |
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) | ATCC | PCS800011 | Can be from other vendors. |
RPMI 1640 Medium | Biological Industries | 01-103-1A | Can be from other vendors. |
L-Glutamine Solution (200 mM) | Biological Industries | 03-020-1B | Can be from other vendors. |
Penicillin-Streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | Can be from other vendors. |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade | Biological Industries | 04-127-1 | Can be from other vendors. |
MACS CD4 microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Anti-Human CD4 FITC | Biogems | 06121-50 | |
Mouse IgG1 Isotype Control FITC | Biogems | 44212-50 | |
Anti-Human CD3 (OKT3) | Tonbo biosciences | 40-0037 | |
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified | Biogems | 10311-25 | |
Recombinant Human IL2 | Peprotech | 200-02 | |
Recombinant Human IL4 | Peprotech | 200-04 | |
Recombinant Human IL12 p70 | Peprotech | 200-12 | |
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) | Tonbo | 40-7048 | |
LEAF Purified anti-human IFN-γ | BioLegend | 506513 | |
NaCl, analytical grade | Carlo Erba | 479687 | Can be from other vendors. |
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade | Calbiochem | 442611 | Can be from other vendors. |
EDTA | MP Biomedicals | 800682 | Can be from other vendors. |
Tris, ultra pure, 99.9% pure | MP Biomedicals | 819620 | Can be from other vendors. |
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) | Calbiochem | 492016 | Can be from other vendors. |
Protease Inhibitors | Sigma | P2714 | this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water. |
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads | Beckman | 63881 | |
PCR purification kit | HyLabs | EX-GP200 | Can be from other vendors. |
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) | Illumina | FC-121-1030 | |
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | |
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543 | |
SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 185-5200 | Can be from other vendors. |
CFX Manager Software | Bio-rad | 1845000 | |
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5124 | Can be from other vendors. |
Qubit fluorometer 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
Magnet for eppendorf tubes | Invitrogen | 12321D | Can be from other vendors. |
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes | Thermo Scientific | 75004527 | Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes. |
Thermo-shaker | MRC | Can be from other vendors. | |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
4200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2991AA | Tape-based platform for electrophoresis |
High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis |
Primer name and sequence | Company | ||
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCGTCGGCAGCGTC AGATGTG-3' |
IDT | Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3' | |
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG GCTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG CTCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC TCGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT CGGAGATGT-3' |
IDT | Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3' | |
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' | IDT | ||
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' | IDT | ||
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' | IDT | ||
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' | IDT | ||
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' | IDT | ||
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' | IDT | ||
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' | IDT | ||
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' | IDT |