Summary

Картирование генома всей доступной хроматина в основной человеческий Т-лимфоцитов, ATAC-Seq

Published: November 13, 2017
doi:

Summary

Assay для Транспозаза-доступные Chromatin, в сочетании с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) является геном общесистемной методом для выявления доступных хроматина. Это шаг за шагом протокол ATAC-seq, от молекулярных окончательного вычислительной анализу, оптимизированный для лимфоцитов человека (Th1/Th2). Этот протокол может быть принят исследователи без предварительного опыта в методах секвенирование нового поколения.

Abstract

Assay для Транспозаза-доступны Chromatin с высокой пропускной способностью последовательности (ATAC-seq) — это метод, используемый для идентификации открытых (доступный) регионов хроматина. Эти регионы представляют регуляторных элементов ДНК (например, промоутеров, усилители, локус контроля регионов, изоляторы), в котором транскрипции факторов привязки. Отображение доступных хроматина пейзаж является мощный подход для выявления активных нормативных элементов по всему геному. Эта информация служит беспристрастный подход для обнаружения сети соответствующих транскрипционных факторов и механизмов структуры хроматина, которые управляют программами выражения гена. ATAC-seq является надежной и чувствительных альтернативой DNase I Гиперчувствительность анализ в сочетании с следующего поколения последовательности (DNase-seq) и при содействии формальдегида изоляции регуляторных элементов (Фэр seq) для анализа генома общесистемной хроматина доступность и последовательность Микрококковая Нуклеаза чувствительных участков (MNase-seq) для определения позиционирования нуклеосома. Мы представляем подробную ATAC-seq протокол, оптимизированный для человека первичной иммунной клетки т.е. CD4 + лимфоцитов (Т-хелперами 1 (Th1) и Th2 клетки). Этот всеобъемлющий протокол начинается с клетки урожая, а затем описывает молекулярное процедура tagmentation хроматина, пробоподготовка для виртуализации нового поколения и также включает методы и соображения для вычислений анализа используется для интерпретировать полученные результаты. Кроме того чтобы сэкономить время и деньги, мы ввели меры контроля качества для оценки ATAC-seq библиотеки до последовательности. Важно отметить, что принципы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют его адаптации в другие клетки человека иммунной и неиммунизированных начальных и клеточных линий. Эти руководящие принципы также будут полезны для лабораторий, которые не владеют методами секвенирование нового поколения.

Introduction

ATAC-seq1,2 — надежный метод, который позволяет идентифицировать регулирования3 открытых хроматина регионов и позиционирования нуклеосома. Эта информация применяется для определения местоположения, личность и активности транскрипционных факторов. Чувствительность метода для измерения количественных различий в структуре хроматина позволяет изучение деятельности хроматина факторов, включая хроматина ремонтом и модификаторов, а также транскрипционный анализ деятельности РНК полимеразой II1. Таким образом ATAC-seq обеспечивает мощный и непредвзятого подхода для расшифровки механизмов, которые регулируют регуляцию в любой тип клеток интереса. Мы описываем адаптации ATAC-seq для первичного Th1 и Th2 клетки человека.

В ATAC-seq гиперактивный Tn5 Транспозаза загружен с переходниками для следующего поколения последовательности (НГС) пары фрагментацию ДНК с разметкой ДНК с адаптеров (т.е., процесс «tagmentation»)1. После амплификации PCR в результате библиотеки ДНК готовы для следующего поколения последовательности (рис. 1). Льготные tagmentation доступных хроматина обнаруживается анализ местного обогащения ATAC-seq последовательность читает.

Короткие экспериментальной процедуры и требования для меньше исходного материала, относительно других методов для измерения доступности хроматина и nucleosomal позиционирования DNase-seq4, Фэр seq5и6MNase-seq имеет поощрять использование ATAC-seq в нескольких биологических систем, включая человеческие клетки первичной1,7 и8клинических образцов, а также одноклеточные организмы9,10растений, плодовых мух11 и различных млекопитающих12.

Личность транскрипции, факторы, которые связаны с доступными локусов можно обнаружили анализ обогащения их мотивы последовательности привязки или сочетаются ATAC-seq chromatin иммунопреципитации (чип) следуют высок объём (секвенирование ДНК ChIP-seq). Этот подход позволил идентификации линии специфических транскрипционных факторов важно для кроветворения в мыши13. Беспристрастной и глобальный характер ATAC-seq позволяет изучение гена регулирование в организмов, для которых реагенты, такие как антитела для анализа чипа не доступны. Например, эволюционные изменения в СНГ-регулирования регионах были определены путем изучения черепной нейронные крест клетки человека и шимпанзе14, развития изменения в регуляторных элементов во время ранних мыши Эмбриогенез15, изменения в нормативно-правовой ландшафт во время жизненного цикла одноклеточными C. owzarzaki9и эволюция промоутеров и усилители через 20 млекопитающих видов12.

ATAC-seq также играет важную роль для измерения доступности хроматина в одиночных клетках, таким образом показывая изменчивость в клеточных популяций, который обычно избегает генома общесистемного исследования7,16. Кроме того ATAC-seq может использоваться для изучения изменений, которые происходят в ДНК нормативных областях в условиях заболевания, в которых образцы редки. К примеру, ATAC-seq может использоваться для изучения изменений в нормативно-правовой ландшафт во время наступления острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)17 или рас-driven онкогенеза11.

Protocol

все процедуры были одобрены Советом институциональный обзор Бар-Иланского университета и протокол руководящим комитетом, утверждении экспериментов. 1. очищение от наивного CD4 + клеток человека и поляризации T вспомогательный 1 (Th1) и Th2 клетки Примечание: зд…

Representative Results

Окончательный результат этого протокола является библиотека ATAC-seq обычно 3-20 нг/мкл. При запуске в системе для анализа целостности ДНК (см. Таблицу материалов/оборудования), они показывают внешний вид лестницы как2 (рис. 3A). Средний р…

Discussion

ATAC-seq протокол, описанный здесь успешно применяются для анализа доступных хроматина в Главные ячейки (человека Th1, Th2 клетки и клетки B) а также искусственный клеточных линий (MCF10A молочной железы человека раковые клетки и клетки U261 глиобластома). Применение ATAC-seq в другие типы клеток, может…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается Фондом науки Израиля (Грант 748/14), Мари Кюри интеграции Грант (CIG) – FP7-люди-20013-сиг-618763 и -CORE программа планирования и составления бюджета Комитет и фонд науки Израиль Грант № 41/11.

Materials

50 mL tubes Lumitron LUM-CFT011500-P Can be from other vendors.
Microtubes Axygen Inc MCT-175-C Can be from other vendors.
25 mL serological pipettes Corning Costar 4489 Can be from other vendors.
Tissue culture flask Lumitron LUM-TCF-012-250-P Can be from other vendors.
Countes Automated Cell Counter Invitrogen C10227
NucleoSpin Tissue MACHEREY-NAGEL 740952.5
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) ATCC  PCS­800­011 Can be from other vendors.
RPMI 1640 Medium Biological Industries 01-103-1A Can be from other vendors.
L-Glutamine Solution (200 mM) Biological Industries 03-020-1B Can be from other vendors.
Penicillin-Streptomycin Biological Industries 03-031-1B Can be from other vendors.
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated, European Grade Biological Industries 04-127-1 Can be from other vendors.
MACS CD4 microbeads, human Miltenyi Biotec 130-045-101
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Anti-Human CD4 FITC Biogems 06121-50
Mouse IgG1 Isotype Control FITC Biogems 44212-50
Anti-Human CD3 (OKT3) Tonbo biosciences 40-0037
Anti-Human CD28 SAFIRE Purified Biogems 10311-25
Recombinant Human IL2 Peprotech 200-02
Recombinant Human IL4 Peprotech 200-04
Recombinant Human IL12 p70 Peprotech 200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2) Tonbo 40-7048
LEAF Purified anti-human IFN-γ BioLegend 506513
NaCl, analytical grade Carlo Erba 479687 Can be from other vendors.
Magnesium chloride, Hexahydrate, molecular biology grade Calbiochem 442611 Can be from other vendors.
EDTA MP Biomedicals 800682 Can be from other vendors.
Tris, ultra pure, 99.9% pure MP Biomedicals 819620 Can be from other vendors.
NP-40 alternative (Nonylphenyl Polyethylene Glycol) Calbiochem 492016 Can be from other vendors.
Protease Inhibitors Sigma P2714 this protease inhibitor coctail is a powder. To make 100 x solution dilute in 1 mL of molecular-biology grade water.
Magnetic solid phase reverse immobilization beads: AMPure XP beads Beckman 63881
PCR purification kit HyLabs EX-GP200 Can be from other vendors.
Nextera DNA Library Preparation Kit (TDE1 transposase and TD buffer) Illumina FC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master Mix New England BioLabs M0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543
SYBR Green I  Invitrogen S7585
 CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio-rad 185-5200 Can be from other vendors.
CFX Manager Software Bio-rad 1845000
master mix for qPCR: iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad 172-5124 Can be from other vendors.
Qubit fluorometer 2.0 Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
Magnet for eppendorf tubes Invitrogen 12321D Can be from other vendors.
Swing bucket cooling centrifuge with the buckets for 15 mL falcon tubes and eppendorf tubes Thermo Scientific 75004527 Could be from other vendors. It is important that it has buckets for eppendorf tubes.
Thermo-shaker MRC Can be from other vendors.
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5585
4200 TapeStation system Agilent Technologies G2991AA Tape-based platform for  electrophoresis
High Sensitivity DNA kit Agilent Technologies 5067-4626 Reagent for high-sensitivity TapeStation analysis
Primer name and sequence Company
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'
IDT Ad1-noMx: 5'-P5 sequence-transposase sequence-3'
Ad2.1_TAAGGCGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.1_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.2_CGTACTAG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.2_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.3_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.4_TCCTGAGC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.4_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.5_GGACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.5_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.6_TAGGCATG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.6_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.7_CTCTCTAC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.7_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.8_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.9_GCTACGCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.9_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.10_CGAGGCTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG
GCTCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.10_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.11_AAGAGGCA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.11_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.12_GTAGAGGA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.12_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.13_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.14_ACCACTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.14_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.15_TGGATCTG: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.15_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.16_CCGTTTGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.16_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
 Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.17_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
 Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.18_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.19_AGGTTGGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.19_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
 Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.20_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
 Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'
IDT Ad2.21_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.22_TGGTCACA: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGCT
CGGAGATGT-3'
IDT Ad2.22_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.23_TTGACCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGCT
CGGAGATGT-3'
IDT Ad2.23_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
Ad2.24_CCACTCCT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGGCT
CGGAGATGT-3'
IDT Ad2.24_expected index sequence read: 5'-P7 sequence-[index sequence]-transposase sequence-3'
F1: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3' IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3' IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3' IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3' IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3' IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3' IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3' IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3' IDT

References

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Curr Protoc Mol Biol. , 21.29.1-21.29.9 (2015).
  3. Thurman, R. E., Rynes, E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  4. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2010).
  5. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  6. Cui, K., Zhao, K. Genome-Wide Approaches to Determining Nucleosome Occupancy in Metazoans Using MNase-Seq. Methods Mol Biol. 833, 413-419 (2012).
  7. Qu, K., et al. Individuality and Variation of Personal Regulomes in Primary Human T Cells. Cell Syst. 1 (1), 51-61 (2015).
  8. Scharer, C. D., et al. ATAC-seq on biobanked specimens defines a unique chromatin accessibility structure in naïve SLE B cells. Sci Rep. 6, 27030 (2016).
  9. Sebé-Pedrós, A., et al. The Dynamic Regulatory Genome of Capsaspora and the Origin of Animal Multicellularity. Cell. 165 (5), 1224-1237 (2016).
  10. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Res. 45 (6), e41 (2016).
  11. Davie, K., et al. Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling. PLOS Genet. 11 (2), (2015).
  12. Villar, D., et al. Enhancer Evolution across 20 Mammalian Species. Cell. 160 (3), 554-566 (2015).
  13. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  14. Prescott, S. L., et al. Enhancer Divergence and cis-Regulatory Evolution in the Human and Chimp Neural Crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  15. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
  16. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  17. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nat Genet. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  18. Jenner, R. G., et al. The transcription factors T-bet and GATA-3 control alternative pathways of T-cell differentiation through a shared set of target genes. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (42), 17876-17881 (2009).
  19. DeAngelis, M. M., Wang, D. G., Hawkins, T. L. Solid-phase reversible immobilization for the isolation of PCR products. Nucleic Acids Res. 23 (22), 4742-4743 (1995).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Biol. 12 (2), R18 (2011).
  21. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  22. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  23. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  25. Meyer, C. A., Shirley Liu, X. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat Rev Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  26. He, H. H., et al. Refined DNase-seq protocol and data analysis reveals intrinsic bias in transcription factor footprint identification. Nat Methods. 11 (1), 73-78 (2013).
  27. Madrigal, P. On Accounting for Sequence-Specific Bias in Genome-Wide Chromatin Accessibility Experiments: Recent Advances and Contradictions. Front Bioeng Biotechnol. 3, 1-4 (2015).
  28. Qin, Q., et al. ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline. BMC Bioinformatics. 17 (1), (2016).
  29. Bao, X., et al. A novel ATAC-seq approach reveals lineage-specific reinforcement of the open chromatin landscape via cooperation between BAF and p63. Genome Biol. 16 (1), 284 (2015).
  30. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).

Play Video

Cite This Article
Grbesa, I., Tannenbaum, M., Sarusi-Portuguez, A., Schwartz, M., Hakim, O. Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq. J. Vis. Exp. (129), e56313, doi:10.3791/56313 (2017).

View Video