ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金
Summary
流れ cytometry ベースの人間のナチュラル キラー細胞の細胞傷害活性を定量的に決定する方法を示しています。
Abstract
自然免疫系のエフェクター リンパ球のナチュラル キラー (NK) 細胞として知られている重要な役割宿主防御において異常な細胞、特に腫瘍を排除し、ウイルス感染細胞に対する。他の病理学の条件のホストとともに、約 30 知られているイネの欠陥では、機能または古典的な NK 細胞欠乏症を引き起こす、けんしょうの減少や細胞傷害活性を欠席します。歴史的には、細胞毒性を面倒な高価な潜在的に有害である放射性の方法で調べた。この資料では、合理化された、臨床応用可能な流れ cytometry ベースの NK 細胞の細胞傷害活性を定量化する方法について説明します。この分析では、末梢血単核球 (PBMCs) または NK 細胞純化は、異なる比率で共存培養 NK 細胞性細胞毒性 (NKCC) に敏感であると知られているターゲット腫瘍細胞株。標的細胞はエフェクター細胞 (NK 細胞) から差別を許可する蛍光色素をあらかじめラベルを。潜伏期間後殺された標的細胞は、死んだ細胞に浸透する具体的には核酸の汚れによって識別されます。このメソッドは、診断や研究用途との両方、フローサイトメトリーのマルチパラ メーター機能のおかげで影響を受けやすい可能性のある NK 細胞の表現型と機能のより深い分析を可能にする利点があります。
Introduction
ナチュラル キラー (NK) 細胞は、人間の生得的なリンパ球批判的に他の病原性の脅威1,2トランス ホーム細胞、ウイルス感染細胞の排除に関与の洗練されたサブセットです。NK 細胞溶解顆粒細胞傷害性タンパク質、パーフォリンなど granzymes の家します。起動時に、NK 細胞は直接ターゲット セル換散とサイトカインとケモカインの放出とともにアポトーシスの結果これらの細胞傷害性の分子がリリースされたローカルという免疫学のシナプスと呼ばれる、ターゲットとの複雑な相互作用を形成し、最終的に、炎症の誘導で1,3,4の状態します。
NK 細胞の活性化を含む複雑な文字列を活性化と抑制相互 NK 細胞受容体とリガンドの堅く調整されたシステムの形成、標的細胞の表面に発現します。NK 細胞の活性化の最も研究のメカニズムの 1 つは、「行方不明自己」です。確かに組織適合性の複雑な (MHC)、または人間の白血球の抗原 (HLA) 分子を主要なクラスの検出の欠如感染または細胞トリガー NK 細胞障害活性を変換します。腫瘍、ウイルス感染細胞レセプター一般的に NK になる T 細胞性免疫能を脱出するこれらの抗原細胞ターゲット1,3,4。
NK 細胞機能の評価は主に脱顆粒や細胞毒性に分類の試金。ただし、脱顆粒関連マーカー CD107a の流れフローサイトメトリー検出などの脱顆粒の試金は NK 細胞の活性化とそれらの究極の機能は、ターゲット セル5,6,7,8の直接の殺害を示すのみ。したがって、この制限は細胞毒性の試金に指示しより直接的代替として調査官を集めています。
長年「ゴールド スタンダード」T および NK 細胞の細胞媒介性細胞傷害活性を評価するため、クロム リリース試金 (CRA)。CRA は、放射能によって51Cr を用いた標的細胞のラベリングとエフェクター細胞にそれらをインキュベート共同に含まれます。この試金は蛋白質バインド51Cr 培養上清をガンマを数えることで測定することができますリリースでそのセル換散の結果主義が染み込んでください。効果的、このアッセイはさまざまな理由のため問題となる: 困難な標準化 – ことが全体で非現実的な9,10 51Cr の自発的なリリースと放射性51Cr の処分処理高材料費。
非放射性アッセイ、蛍光標識、酵素リリースも生物発光などの数から、CRA 111412,13,,に代わるものとして開発されています。ここで NK 細胞細胞毒性活性 K562 標的細胞に簡単な敏感なと再現性のある測定用フロー フローサイトメトリーを用いた手法について述べる。K562 細胞は、人間 erythroleukemic セル HLA クラスの発現低下と私と NK 細胞媒介性細胞傷害15に特に敏感になる賦活の NK の受容器のための ligands の高められた表現です。このアッセイ K562 細胞 carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) があらかじめ付いていますいずれか末梢血単核球 (Pbmc) の様々 な比率で共培養や NK 細胞1を精製しました。CFSE はエフェクター NK 細胞16,17から標的細胞の判別ができる安定した、蛋白結合蛍光染料です。共培養後核酸染色、特に死んだ細胞の膜を浸透、殺された標的細胞 (材料の表を参照) を識別するために使用されます。流れの cytometer 死者 (すなわち、汚れ +) の割合を決定するために、サンプルを集録し、CFSE + 標的細胞。
この試金は、機能やクラシックの NK 細胞の欠乏を引き起こす約 30 の既知の欠陥がある NK 細胞コンパートメントに影響を与えるイネの欠陥、プライマリまたはセカンダリの血球貪食症候群、ルーチンの診断スクリーニングとして使用できます。また、再発、重度のヘルペス ウイルス感染症、造血幹細胞移植またはポスト免疫調節療法18,19、20、次免疫再構築を評価するための基本的な研究アプリケーションのホストのため患者の NK 細胞活性を調査することをお勧めします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したメソッドは、NK 細胞の細胞傷害活性を評価するために伝統的な51Cr リリース試金する簡単かつコスト効果の高い代替手段を提供します。このメソッドは、機密性の高い、再現と CRA のような前の標準的な方法より手間がかからずと臨床の両方に使用できます、アプリケーションを研究します。
アッセイ作品合計 PBMCs と濃縮の NK 細胞は、細胞集団を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは彼女については原稿を準備するジル ナルシソ、UCLA 免疫遺伝学センターを感謝したいです。
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
