Здесь показан поток на основе цитометрии метод количественно определить цитотоксическую активность человека естественных клеток-киллеров.
В пределах иммунной системы эффекторные лимфоциты, известный как естественный убийца (НК) клетки играют важную роль в принимающей обороны против аберрантных клеток, специально устраняя опухолевых и вирусно зараженных клеток. Около 30 известных моногенных дефектов, наряду с множеством других патологических состояний, вызвать функциональные или классический NK клеток дефицит, проявляется в снижена или отсутствует цитотоксической активности. Исторически цитотоксичность исследована с радиоактивных методов, которые являются громоздкой, дорогостоящей и потенциально опасными. Эта статья описывает метод, основанный на цитометрии обтекаемый, клинически применимых потока для количественного определения цитотоксическую активность NK клеток. В этот assay мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток препараты совместно инкубируют в различных соотношениях с целевой линии клеток опухоли, известный быть чувствительным к НК клеточный цитотоксичности (NKCC). Клетки-мишени предварительно помечены с Люминесцентную краску, чтобы позволить их дискриминацию с эффекторных клеток (НК-клеток). После инкубационного периода убитых целевых ячеек определяются по пятно нуклеиновой кислоты, который специально проникает мертвых клеток. Этот метод является поддаются как диагностических и исследовательских приложениях и, благодаря возможности Многопараметрический проточной цитометрии, имеет дополнительное преимущество, потенциально позволяя более глубокий анализ фенотипа NK клеток и функции.
Природные убийца (НК) клетки являются подмножеством сложные лимфоцитов человека врожденной критически участвующих в ликвидации вирусно зараженных клеток, трансформированных клеток и другие патогенные угроз 1,2. NK клеток литические гранулы дом цитотоксических белков, таких как Перфорины и granzymes. После активации НК-клетки образуют сложное взаимодействие с их целями, известный как иммунологический синапса, whereby эти цитолитических молекулы локально выпускаются, приводит к прямой целевой лизис клеток и апоптоз, вместе с цитокинов и хемокиновых релиз и в конечном итоге в индукции воспалительных состояние 1,3,4.
Активации клеток NK предполагает сложную строку активации и тормозящий взаимодействий между НК клеток рецепторов и лигандами, выраженные на поверхности клеток-мишеней, образуя жестко регулируемой системы. Одним из наиболее изученных механизмов активации клеток NK является «пропавших без вести себя». Действительно отсутствие определения класса, который я основной комплекс гистосовместимости (MHC), или человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) молекулы, на зараженных или преобразованы клетки триггеры NK клеток цитотоксичности. Опухоли и инфицированные вирусом клетки обычно помощью Эти антигены бежать T клеточный иммунитет, таким образом став основной NK клеток цели 1,3,4.
Оценка функции NK клеток главным образом разделить дегрануляции или цитотоксичности анализов. Однако дегрануляция анализов, например обнаружение потока гранулярных дегрануляции ассоциированного маркера CD107a, только ориентировочные активации НК клеток, а не их конечной функции, прямое убийство целевых ячеек 5,6,,78. Таким образом это ограничение было обращено следователи цитотоксичность анализов в качестве альтернативы более ярким и более прямой.
Долгое время «золотым стандартом» для оценки cell-mediated цитотоксическую активность T и NK клеток является пробирного выпуска хрома (CRA). CRA подразумевает радиоактивно маркировки целевых ячеек с 51Cr и совместно инкубации их с эффекторных клеток. Этот assay погружен в принципе, что лизис клеток приводит в выпуске белка прыгните 51Cr в надосадке, который может быть измерен путем подсчета гамма. Этот assay, время эффективным, является проблематичным для целого ряда причин: высокие затраты на материалы, обращения и утилизации радиоактивных 51Cr, спонтанное выпуск 51Cr и трудно стандартизации – что делает его совершенно непрактично 9,10.
С тех пор, был разработан ряд нерадиоактивные анализов, с участием люминесцентные маркировки, фермент релиз и даже биолюминесценции, как альтернативы CRA 11,12,,1314. Здесь мы описываем потока на основе цитометрии метод измерения NK клеток цитотоксической активности на клетки-мишени K562, простой, чувствительной и воспроизводимость. K562 клетки являются клетки человеческого erythroleukemic линии с сокращением выражение HLA класса I и повышенной выражение лигандов для activatory NK рецепторов, что делает их особенно подверженными НК клеточный цитотоксичность 15. В этот assay клетках K562 предварительно помечены Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира (CFSE) и совместно культивируемых в различных соотношениях с либо мононуклеаров периферической крови (получения) или очищенного NK клеток 1. CFSE является стабильной, связывание с белками Люминесцентную краску, которая позволяет дискриминацию клеток-мишеней от эффекторных NK клеток 16,17. После совместного инкубации пятно нуклеиновой кислоты, специально пронизывающей мембраны мертвых клеток, используется для идентификации погибших целевых клеток (см. таблицу материалов). Затем образцы приобретаются на проточный цитометр определить процент умерших (то есть, stain +) CFSE + клеток-мишеней.
Этот assay может использоваться как Рутинный скрининг диагностики для Моногенные дефектов, влияющих на отсеке NK клеток, которых насчитывается около 30 известных дефектов, вызывая функциональных или классический NK клеток дефицит, и первичный или вторичный гемофагоцитный лимфогистиоцитоз. Это также полезно для расследования НК-клеточной активности у больных с периодические, тяжелая герпеса вирусных инфекций, для оценки иммунного восстановления после трансплантации гемопоэтических клеток или пост иммуномодулирующей терапии 18,19,20и за целый ряд фундаментальных исследований приложений.
Метод, описанный здесь представляет собой простой и экономически альтернативу традиционной 51Cr релиз assay оценить активность цитотоксических клеток НК. Этот метод чувствительных, воспроизводимые и меньше времени, чем предыдущие стандартные методы, как АКБ и может использоваться ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Джилл Narciso, иммуногенетики центр UCLA, за её помощь в подготовке рукописи.
Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
Serological pipettes | BD Falcon | ||
Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |