Summary

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Published: August 09, 2017
doi:

Summary

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l’attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Abstract

All’interno del sistema immunitario innato, linfociti effettori conosciuti come cellule natural killer (NK) svolgono un ruolo essenziale nella difesa dell’ospite contro le cellule aberranti, in particolare eliminando tumorali e cellule infette viralmente. Circa 30 difetti noti monogenici, insieme a una serie di altre condizioni patologiche, causano la mancanza delle cellule NK sia funzionale o classica, che si manifesta ridotta o assente attività citotossica. Storicamente, la citotossicità è stata studiata con metodi radioattivi, che sono ingombranti, costosi e potenzialmente pericolose. Questo articolo viene descritto un metodo di base di cytometry di flusso aerodinamico, clinicamente applicabile per quantificare l’attività citotossica delle cellule NK. In questo saggio, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o preparazioni purificate di cellule NK sono co-incubate a diversi rapporti con una linea cellulare di tumore destinazione conosciuta ad essere sensibili alla citotossicità cellulo-mediata NK (NKCC). Le cellule bersaglio sono pre-etichettate con un colorante fluorescente per permettere la loro distinzione dalle cellule effettrici (cellule NK). Dopo il periodo di incubazione, le cellule bersaglio uccisi sono identificate da una macchia di acido nucleico, che permea in modo specifico le cellule morte. Questo metodo è favorevole alla sia diagnostico e applicazioni di ricerca e, grazie alle funzionalità multi-parametro di citometria a flusso, presenta il vantaggio aggiunto di potenzialmente consentire un’analisi più approfondita del fenotipo delle cellule NK e funzione.

Introduction

Cellule natural killer (NK) sono un sottoinsieme sofisticato dei linfociti umani innati criticamente coinvolti nell’eliminazione delle cellule infettate viralmente, cellule trasformate e altri patogeni minacce 1,2. Granuli litici delle cellule di NK casa proteine citotossiche, come perforine e granzimi. Al momento dell’attivazione, le cellule NK formano una complessa interazione con i loro obiettivi conosciuto come sinapsi immunologica, per cui queste molecole citolitiche localmente vengono rilasciate, con conseguente lisi delle cellule bersaglio diretto e apoptosi, insieme al rilascio di citochine e chemochine e, infine, l’induzione di un infiammatorio stato 1,3,4.

Attivazione delle cellule NK coinvolge una stringa complessa di attivazione e inibitorie interazioni tra NK delle cellule recettori e ligandi espressi sulla superficie delle cellule bersaglio, formando un sistema strettamente regolato. Uno dei più studiati meccanismi di attivazione delle cellule NK è il “sé mancante”. Infatti, mancanza di rilevazione di classe che maggiore istocompatibilità (MHC), o umano del leucocita (HLA) l’antigene molecole, il infetti o trasformato la citotossicità delle cellule NK di cellule trigger. Tumore e cellule infettate da virus generalmente downregulate questi antigeni di fuggire immunità comunicata per cellule di T, diventando così NK primario delle cellule target 1,3,4.

Valutazione della funzione delle cellule NK è principalmente suddivise in degranulazione o citotossicità saggi. Tuttavia, test di degranulazione, quali il rilevamento di cytometric di flusso del marcatore associato degranulazione CD107a, sono indicativi dell’attivazione delle cellule NK e non della loro funzione finale, l’uccisione diretta di destinazione celle 5,6,7,8. Quindi, questa limitazione ha attirato gli investigatori a saggi di citotossicità come un’alternativa più eloquente e più diretto.

Da sempre “gold standard” per la valutazione della attività citotossica cellulo-mediata delle cellule NK e T è il test di rilascio di cromo (CRA). CRA coinvolge radioattivo etichettatura delle cellule bersaglio con 51Cr e co-incubarle con cellule effettrici. Questo test è immersa nel principio che la lisi delle cellule provoca il rilascio di legato alle proteine 51Cr nel surnatante, che può essere misurato contando gamma. Questo test, mentre efficaci, è problematico per una serie di motivi: costi elevati di materiale, manipolazione e smaltimento di radioattivo 51Cr, rilascio spontaneo di 51Cr e difficile standardizzazione – rendendolo del tutto impraticabile 9,10.

Una serie di saggi non radioattivo, che coinvolgono etichettatura fluorescente, rilascio di enzimi e anche bioluminescenza, allora è stata sviluppata come alternative al CRA 11,12,13,14. Descriviamo qui un metodo di basato su citometria di flusso per la misura di attività delle cellule NK citotossica sulle cellule bersaglio K562 che è semplice, sensibile e riproducibile. Le cellule K562 sono una cellula umana eritroleucemiche linea con riduzione dell’espressione di molecole HLA di classe I ed espressione intensificata di ligandi per recettori NK attivatori, che li rende particolarmente suscettibili a NK Citotossicità cellulo-mediata 15. In questa analisi, le cellule K562 sono pre-etichettate con carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) e co-coltivate a vari rapporti con entrambi cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) o purificata di cellule NK 1. CFSE è un colorante fluorescente stabile, legame che consente di discriminazione delle cellule bersaglio da effettore NK cellule 16,17. Dopo la co-incubazione, una macchia di acido nucleico, specificamente che permea la membrana di cellule morte, viene utilizzata per identificare le celle di destinazione ucciso (Vedi tabella dei materiali). I campioni vengono quindi acquisiti su un citometro a flusso per determinare la percentuale di morti (cioè, macchia +) CFSE + cellule bersaglio.

Questa analisi può essere usata come uno screening diagnostico per malattie monogenici difetti che interessano il compartimento cellulare NK, di cui ci sono circa 30 difetti noti causando carenza di cellule NK o funzionale o classica, e per il lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secondario. È anche utile indagare l’attività delle cellule NK in pazienti con infezioni virali da herpes ricorrente, grave, di valutare la ricostituzione immunitaria dopo trapianto di cellule ematopoietiche o post immunomodulatori terapia 18,19,20e per una miriade di applicazioni di ricerca di base.

Protocol

Samples were collected according to the ethical guidelines established by the UCLA Human Research Protection Program and IRB approved. 1. Preparation of reagents NOTE: Unless otherwise stated, all reagents should be allowed to equilibrate at room temperature prior to use. All reagents must remain sterile. Prepare a 2x working solution of Tween-20 (i.e., 0.2%) by adding 10 µL of Tween-20 solution to 5 mL of phosphate-buffered saline (PBS) withou…

Representative Results

Prima di impostare il dosaggio, si consiglia vivamente che contenuto delle cellule NK essere valutata nella popolazione dell’effettore di scelta. La figura 1 Mostra una tipica colorazione CD56 prima (luce blu) e dopo arricchimento di cellule NK (rosso). Le cellule NK comprendono fino a 15% di PBMCs e devono essere almeno 80% puro dopo arricchimento. Analisi cytometric di flusso in questo test compor…

Discussion

Il metodo qui descritto fornisce un’alternativa semplice e conveniente per il test di rilascio di Cr tradizionale 51per valutare l’attività citotossica delle cellule NK. Questo metodo è sensibile, riproducibile e richiede meno tempo rispetto ai metodi standard precedenti, come CRA e può essere usato per entrambi clinici e applicazioni di ricerca.

Mentre il dosaggio funziona sia con totale PBMCs e arricchito le cellule NK, l’opzione per utilizzare PBMCs senza la necessità di puri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Center, per la sua assistenza con la preparazione del manoscritto.

Materials

Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) Corning (Cellgro) 21-040-CM
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02
Tween-20 Sigma BP337-100
RPMI 1640 Media Corning (Cellgro) 10-040-CV
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140-163 Stock solution at 10,000 U/mL
IL-2 R&D Systems 202-IL-050 Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)
K562 Cells ATCC CCL-243 Cancer cell line 
T-75 cell culture flasks Corning 431464
CFSE cell proliferation kit Life Technologies (CellTrace) C34554 Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.
Sytox Red Life Technologies S34859 Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.
Sodium/lithium heparin blood collection tubes BD 02-687-95
U-bottom 96-well plate Corning CLS3897
Serological pipettes BD Falcon
Polystyrene round-bottom tubes (5mL) BD Falcon 14959-5
50 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352070
15 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352097
Reagent reservoir USA Scientific 2321-2230
Human NK cell enrichment cocktail StemCell Technologies (RosetteSep) 15065

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Cite This Article
Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. J. Vis. Exp. (126), e56191, doi:10.3791/56191 (2017).

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