Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine
Summary
Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.
Abstract
Au sein du système immunitaire inné, lymphocytes effecteurs natural killer (NK) cellules jouent un rôle essentiel dans la défense de l’hôte contre les cellules anormales, éliminant notamment tumoraux et virale des cellules infectées. Environ 30 anomalies monogéniques connus, ainsi qu’une foule d’autres pathologies, causent soit fonctionnelle ou classique carence cellulaire NK, se manifestant dans réduite ou absente une activité cytotoxique. Historiquement, la cytotoxicité a été étudiée avec les méthodes radioactives, qui sont encombrants, coûteux et potentiellement dangereux. Cet article décrit une méthode d’axée sur la cytométrie de flux rationalisé, cliniquement applicables afin de quantifier l’activité cytotoxique des cellules NK. Dans ce test, les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ou des préparations de cellules NK purifiées sont conjointement incubées à différentes proportions avec une lignée de cellules tumorales de cible qui sont sensibles à la cytotoxicité des cellules NK (NKCC). Les cellules cibles sont préalablement étiquetées avec un colorant fluorescent pour permettre leur discrimination des cellules effectrices (cellules NK). Après la période d’incubation, les cellules cibles tués sont identifiés par une tache d’acide nucléique, qui imprègne spécifiquement les cellules mortes. Cette méthode se prête à la fois diagnostique et des applications de recherche et, grâce aux capacités multiparamétriques de la cytométrie en flux, a l’avantage supplémentaire de permettre éventuellement une analyse plus approfondie du phénotype des cellules NK et la fonction.
Introduction
Cellules tueuses naturelles de (NK) sont un sous-ensemble sophistiqué des lymphocytes humains d’innée critique impliqués dans l’élimination des cellules infectées virally, cellules transformées et autres menaces pathogènes 1,2. Granules lytiques de cellules NK maison cytotoxiques protéines, comme la perforine et granzymes. Lors de leur activation, les cellules NK forment une interaction complexe avec leurs cibles appelées synapse immunologique, auquel cas ces molécules cytotoxiques sont localement libérés, ce qui entraîne la lyse des cellules cibles directes et l’apoptose, ainsi que de la libération de cytokines et de chimiokines et finalement dans l’induction d’un inflammatoire état 1,3,4.
Activation des cellules NK implique une chaîne complexe de l’activation et inhibitrices interactions entre NK cellules récepteurs et ligands exprimés à la surface des cellules cibles, formant un système étroitement réglementé. Un des mécanismes plus étudiés de l’activation des cellules NK est le « soi manquant ». En effet, absence de détection de classe sur que j’ai major complexe d’histocompatibilité (CMH) ou human leucocyte antigen (HLA) molécules, infectés ou transformé la cytotoxicité des cellules NK cellules déclencheurs. Tumeur et les cellules infectées par le virus en général régulent ces antigènes pour échapper l’immunité cellulaire T, devenant ainsi le principal NK cellules cibles 1,3,4.
Évaluation de la fonction des cellules NK principalement dans la catégorie dégranulation ou la cytotoxicité des essais. Cependant, les essais de dégranulation, telles que la détection de cytométrie en flux du marqueur dégranulation associée à CD107a, ne sont qu’indicatifs d’activation des cellules NK et non de leur fonction ultime, la mort directe de cible les cellules 5,6,7,8. Par conséquent, cette limitation a attiré enquêteurs aux analyses de cytotoxicité comme une alternative plus éloquent et plus directe.
La longue date « gold standard » pour évaluer l’activité cytotoxique à médiation cellulaire des cellules T et NK est le test de libération chrome (ARC). L’arc implique radiologiquement marquage de cellules cibles avec 51Cr et incuber conjointement avec les cellules effectrices. Ce dosage est ancré dans le principe que la lyse cellulaire entraîne la libération de protéinique 51Cr dans le surnageant, qui peut être mesuré en comptant les gamma. Ce test, bien qu’efficace, est problématique pour plusieurs raisons : des coûts élevés de matière, manipulation et élimination des radioactifs 51Cr, libération spontanée de 51Cr et normalisation difficile – ce qui en fait tout à fait irréaliste 9,10.
Un certain nombre d’essais non radioactif, impliquant le marquage fluorescent, la libération de l’enzyme et même bioluminescence, ont depuis été développé comme solution de rechange à l’arc 11,12,13,14. Nous décrivons ici une méthode axée sur la cytométrie de flux pour la mesure des NK cellule cytotoxique sur les cellules K562 cible qui est simple, sensible et reproductible. Les cellules K562 sont une cellule humaine érythroleucémiques line avec une expression réduite des molécules HLA de classe I et expression accrue des ligands pour des récepteurs NK activatrices, ce qui les rend particulièrement sensibles à la cytotoxicité à médiation cellulaire NK 15. Dans cet essai, cellules K562 sont préalablement étiquetées avec carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFSE) et co cultivées à divers rapports avec deux cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ou purifiée de cellules NK 1. CFSE est un colorant fluorescent stable, protéine liant qui permet à la discrimination des cellules cibles de l’effecteur NK cellules 16,17. Après l’incubation Co, une tache d’acide nucléique, spécifiquement imprégnant la membrane des cellules mortes, est utilisée pour identifier les cellules de cible tuée (voir table des matières). Les échantillons sont ensuite acquis sur un cytomètre en flux pour déterminer le pourcentage de morts (c.-à-d., tache +) CFSE + cellules cibles.
Ce dosage peut servir d’un dépistage systématique pour monogéniques défauts affectant le compartiment de cellules NK, dont il existe environ 30 défauts connus provoquant le déficit de cellules NK soit fonctionnelle ou classique, et familiale hémophagocytique primaire ou secondaire. Il est également utile d’examiner l’activité des cellules NK chez les patients souffrant d’infections virales herpès récurrent, sévère, d’évaluer la reconstitution immunitaire après greffe de cellules hématopoïétiques ou post immunomodulatrices thérapie 18,19,20et pour une foule d’applications de la recherche fondamentale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici offre une alternative simple et rentable pour le test de libération traditionnel 51Cr pour évaluer l’activité cytotoxique des cellules NK. Cette méthode est sensible, reproductible et moins de temps que les méthodes standards précédents, comme l’arc et peut être utilisée à la fois clinique et les applications de recherche.
Alors que le test fonctionne avec les PBMC total et enrichi les cellules NK, la possibilité d’utiliser des PBMC sans avo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Jill Narciso, UCLA immunogénétique Center, pour son aide avec la préparation du manuscrit.
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
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