Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Doenças transmitidas por mosquitos, como malária, febre do dengue, febre zika e febre amarela, são problemas de saúde pública internacional que continuam a ser responsáveis por uma fração significativa da carga global de doenças infecciosas^1,2. Insecticidas convencionais, que têm sido utilizados em resposta a vetores, são um componente importante da estratégia de controle de mosquito integrado sustentável para a prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, tais estratégias provaram para ser relativamente ineficazes ou indesejáveis devido os impactos ambientais negativos associados, bem como a evolução da resistência no mosquito populações^3,4. Por estas razões, há uma necessidade urgente de métodos alternativos de mosquito controle e o uso de métodos transgênicos para produzir mosquitos machos estéreis e o lançamento de mosquitos resistentes ao patógeno surgiram como promissoras novas estratégias de controle. Para desenvolver novo eficaz controlar métodos, tais como seguras e eficazes abordagens para na vivo entrega de gene, a análise abrangente da função do gene de mosquito é necessária.

Microinjeção direta de plasmídeo, dobro encalhado RNA (dsRNA) ou RNA de interferência pequeno (siRNA) é o mais comumente usado em vivo gene entrega método em mosquitos. Na verdade, a produção de variedades transgênicas de mosquitos ainda dependem de um processo de embrião microinjeção^5,6,7. No entanto, microinjeção tem várias limitações. Em primeiro lugar, esta técnica é tecnicamente exigente e envolve procedimentos complicados. Em segundo lugar, a injeção faz com que um insulto físico para o embrião, larvas, pupas e adultos, que afecta directamente a viabilidade do organismo alvo. Em terceiro lugar, é difícil imobilizar as larvas de mosquito para microinjection porque a maioria vive em um habitat aquático e possuem uma característica que se contorcendo de movimento. Em quarto lugar, o tamanho de 1^st-2^nd ínstar larvas é 10 a 20 vezes menor do que a de 4^th ínstar e larvas mais velhas e as cutículas da antiga são mais delicadas. Estas características tornam difícil de manipular 1^st-2^nd ínstar larvas em comparação com aqueles em estágios mais antigos. Combinados, esses fatores contribuem para uma taxa de sobrevivência de pós-injeção reduzida para larvas (cerca de 5%) em comparação com adultos⁸. Sistemas de entrega baseada em viral foram desenvolvidos para superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, transdução de alta eficiência, a longo prazo e robustos níveis de expressão e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Portanto, gene entrega sistemas utilizando lentivírus, retrovírus e adenovírus foram amplamente utilizado linhas de células inmammalian e espécie de modelo. O sistema de expressão viral de Sindbis tinha sido anteriormente usado para analisar a função do gene no mosquito adulto; Além das preocupações de segurança biológica, no entanto, a injeção é ainda um processo necessário para infecção viral⁹. Embora, a entrega oral por larvas de imersão na solução dsRNA tem sido relatada anteriormente como um método de entrega viável, é inadequada para o pequeno RNA função análise¹⁰. Então, métodos de efetiva entrega viral ainda devem ser desenvolvidos para os mosquitos.

Mosquito densoviruses (MDVs) fazem parte da subfamília Densovirinae de Parvoviridaee uma queda do género Brevidensovirus¹¹. Virions MDV são não-envelopado e consistem de um genoma de DNA (ssDNA) single-stranded e um capsídeo icosaédrica (20 nm de diâmetro). O genoma viral é aproximadamente 4 kb em tamanho e é replicado dentro dos núcleos das células do hospedeiro. MDVs são relativamente estáveis no ambiente e mostram uma gama de hospedeiros estreitas com alta especificidade para os mosquitos. Estes vírus têm o potencial para se espalhar e persistir naturalmente em populações de mosquito e podem invadir quase todos os órgãos e tecidos desses insetos, incluindo o midgut, Malpighi túbulos, gordura corporal, massa muscular, neurônios e glândulas salivares¹².

Genomas MDV intactas podem ser subcloned em vetores do plasmídeo para produzir clones infecciosos baseados no plasmídeo; Quando estes clones são entregues em células de mosquito, o genoma viral é extraído do vetor do plasmídeo, e partículas virais infecciosas são produzidas. Porque MDV tem um genoma pequeno ssDNA, clones infecciosos são facilmente construídos e o genoma viral pode ser facilmente manipulado^11,13. Estas características fazem MDV um valioso agente para examinar a biologia do mosquito. No entanto, porque quase toda a sequência do genoma viral é essencial para proliferação viral, a criação de vírus recombinantes através da substituição ou inserção de genes estrangeiros provoca uma perda na capacidade de embalagens e/ou replicação viral, que cria um barreira para o desenvolvimento de MDVs como vetores de entrega do gene. Neste documento, nós relatamos usando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um rAaeDV não-defeituoso na vivo RNA entrega sistema que tem as vantagens da construção fácil do plasmídeo e a manutenção de um vírus funcional que pode produzir estável e de longo prazo expressão em células hospedeiras, sem a necessidade de vírus do tipo selvagem. Além disso, este método permite a fácil transdução de larvas.

Os protocolos para as etapas a seguir são descritos neste estudo: linha 1) projeto de rAaeDVs codificação uma gaveta intrônicas expressão pequeno-RNA, 2) produção de partículas de vírus recombinantes usando a célula de empacotamento C6/36, 3) análise quantitativa de célula livre rAaeDV genoma copiar números e 4) infecção do Ae. albopictus larvas por introdução directa de vírus para o corpo de água do habitat larval. Em geral, este trabalho demonstrou que RNAs pequeno específico genes-alvo podem ser overexpressed ou derrubados em larvas de mosquito, usando o sistema de entrega MDV desenvolvido.