Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

Maladies transmises par les moustiques comme le paludisme, dengue, fièvre zika et la fièvre jaune, sont des problèmes de santé publique international majeur qui continuent de représenter une fraction significative de la charge mondiale des maladies infectieuses^1,2. Les insecticides classiques, qui ont été utilisés en réponse à des vecteurs, sont une composante majeure de la stratégie de contrôle des moustiques intégrée durable pour la prévention des maladies transmises par les moustiques. Toutefois, ces stratégies sont révélés relativement inefficaces ou indésirable en raison des impacts environnementaux négatifs associés ainsi que l’évolution des résistances dans les populations de moustiques^3,4. Pour ces raisons, il y a un besoin urgent pour des méthodes alternatives de moustique control et l’utilisation de méthodes transgéniques pour produire des moustiques mâles stériles et la libération de moustiques résistant aux agents pathogènes sont apparus comme prometteuses nouvelles stratégies de contrôle. Pour développer apparente nouveau contrôler méthodes, tels que des approches sécuritaires et efficaces pour in vivo la livraison de gène, l’analyse globale de la fonction du gène moustique est nécessaire.

Microinjection directe du plasmide ADN, double stranded RNA (dsRNA) ou petits ARN interférents (siARN) est la plus couramment utilisé en vivo gène méthode de livraison chez les moustiques. En fait, la production de souches transgéniques de moustiques dépendent encore un processus d’embryon microinjection^5,6,7. Toutefois, la microinjection présente plusieurs limites. Tout d’abord, cette technique est techniquement difficile et implique des procédures compliquées. Deuxièmement, l’injection provoque une agression physique à l’embryon, larves, nymphes et adultes, qui affecte directement la viabilité de l’organisme cible. En troisième lieu, il est difficile immobiliser les larves de moustiques pour microinjection parce que la plupart vivent dans un habitat aquatique et possède une caractéristique se tortillant de mouvement. Quatrièmement, la taille de 1^m-2^ème stade larvaire est 10 – 20 fois plus petit que celui de la 4^ème stade larvaire et larves plus âgées et les cuticules du premier sont plus délicats. Ces caractéristiques, il est difficile de manipuler 1^st-2^ème stade larvaire par rapport à ceux des stades plus âgés. Combinés, ces facteurs contribuent à un taux de réduction de la survie après l’injection de larves (environ 5 %) par rapport aux adultes⁸. Base virale livraison systèmes ont été développés afin de surmonter les obstacles extracellulaires et intracellulaires associés. Ces systèmes présentent les avantages de manipulation facile, efficacité élevée de transduction, solides et à long terme des niveaux d’expression et la capacité de produire des effets persistants en vivo. Par conséquent, gène vecteurs utilisant des rétrovirus, lentivirus et adénovirus ont été largement utilisé les lignées inmammalian et espèces modèles. Le système d’expression virus de Sindbis avait été précédemment utilisé pour analyser la fonction du gène dans le moustique adulte ; Outre les préoccupations de sécurité biologique, cependant, l’injection est toujours un processus nécessaire pour infection virale⁹. Même si, à l’administration orale en trempant des larves dans la solution de dsRNA a été signalée auparavant comme un mode de livraison possible, il ne convient pas pour petits RNA fonction analyse¹⁰. Ainsi, méthodes de livraison viral efficace encore il faut développer pour les moustiques.

Mosquito densoviruses (FDM) font partie de la sous-famille des Densovirinae des Parvoviridaeet tous sauf un automne au sein du genre Brevidensovirus¹¹. MDV virions sont non enveloppés et se composent d’un génome d’ADN (ADN simple brin) simple brin et une capside icosaédrique (20 nm de diamètre). Le génome viral est d’environ 4 Ko de taille et est répliqué dans les noyaux des cellules de l’hôte. FDM est relativement stables dans l’environnement et présentent une gamme d’hôtes étroite spécificité élevée pour les moustiques. Ces virus sont susceptibles de se propager et persister naturellement dans les populations de moustiques et peuvent envahir la quasi-totalité des organes et des tissus de ces insectes, y compris l’intestin moyen, Malpighi tubules, corps gras, musculature, neurones et glandes salivaires¹².

Les génomes MDV intacts peuvent être subcloned dans des vecteurs de plasmide pour produire des clones infectieux axée sur le plasmide ; Lorsque ces clones sont livrés dans des cellules de moustique, le génome viral est extraite du vecteur plasmidique, et des particules virales infectieuses sont produites. MDV ayant un génome d’ADN simple brin petite, clones infectieux sont facilement construits et le génome viral peut être facilement manipulables^11,13. Ces caractéristiques rendent MDV un agent précieux pour l’examen de biologie de moustique. Cependant, parce que la quasi-totalité de la séquence du génome viral est essentielle à la prolifération virale, la création de virus recombinants par le remplacement ou l’insertion de gènes étrangers entraîne une perte dans les capacités de conditionnement et/ou de la réplication virales, qui crée une barrière pour le développement de FDM comme vecteurs de livraison de gène. Ici, nous rapportons en utilisant une stratégie artificielle intronic expression de petits ARN pour développer un rAaeDV non défectueux en vivo RNA livraison système qui possède les avantages de la construction plasmidique facile et l’entretien d’un virus fonctionnel qui peut produire expression stable et à long terme dans les cellules de l’hôte sans la nécessité pour le virus de type sauvage. De plus, cette méthode permet la transduction facile des larves.

Les protocoles pour les étapes suivantes sont décrites dans la présente étude : line 1) conception de rAaeDVs codant une cassette d’expression de petits ARN intronic, 2) la production de particules de virus recombinant à emballage de la cellule C6/36, 3) l’analyse quantitative d’acellulaire rAaeDV génome copier numéros et 4) infection des larves Ae. albopictus par incorporation directe du virus dans le plan d’eau de l’habitat larvaire. Dans l’ensemble, ces travaux ont démontré que des petits ARN ou des gènes de cible peuvent être surexprimés ou renversées dans les larves de moustiques en utilisant le système de livraison MDV développé.