Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Muggen overgebrachte ziekten zoals malaria, knokkelkoorts, zika koorts en gele koorts, zijn grote internationale volksgezondheidsproblemen die blijven ter verantwoording voor een belangrijke fractie van de mondiale infectieziekte last^1,2. Conventionele insecticiden, die in reactie op vectoren zijn gebruikt, zijn een belangrijk onderdeel van duurzame geïntegreerde mug strategie voor toegangsbeheer voor de preventie van muggen overgebrachte ziekten. Echter, dergelijke strategieën hebben bewezen relatief inefficiënt of ongewenste als gevolg van de bijbehorende negatieve milieueffecten, alsmede de ontwikkeling van resistentie bij mug populaties^3,4. Om deze redenen is er dringend behoefte aan alternatieve methoden van mug, controle, en het gebruik van transgene methoden voor de productie van steriele mannelijke muggen en de vrijlating van de pathogeen-resistente muggen hebben voorgedaan als veelbelovende nieuwe bestrijdingsstrategieën. Om controle effectieve nieuwe methoden, zoals veilige en effectieve methoden voor in vivo gene levering, de uitgebreide analyse van de genfunctie mug is vereist.

Directe microinjection van plasmide DNA, dubbele stranded RNA (dsRNA) of Klein Mengend RNA (siRNA) is de meest gebruikte in vivo gene leveringsmethode in muggen. In feite, de productie van transgene variëteiten van muggen nog steeds rekenen op een proces van embryo microinjection^5,6,7. Microinjection heeft echter verschillende beperkingen. Ten eerste, deze techniek is technisch veeleisende en impliceert ingewikkelde procedures. Ten tweede veroorzaakt injectie een fysieke belediging van het embryo, larven, poppen en volwassen, die rechtstreeks van invloed op de levensvatbaarheid van het doelorganisme. Ten derde is het moeilijk om te immobiliseren muggenlarven voor microinjection, omdat de meeste in een aquatische habitats leven en bezitten een karakteristiek kronkelende beweging. Ten vierde, de grootte van 1^st-2^nd instar-larven is 10 – aan 20 keer kleiner dan die van 4^th instar en oudere larven en de nagelriemen van de voormalige gevoeliger zijn. Deze functies maken het moeilijk om te manipuleren 1^st-2^nd instar-larven in vergelijking met oudere stadia. Gecombineerd, deze factoren dragen bij aan een verminderde na injectie overlevingspercentage voor larven (ongeveer 5%) in vergelijking met volwassenen⁸. Viral gebaseerde levering systemen zijn ontwikkeld om de bijbehorende extracellulaire en intracellulaire belemmeringen. Deze systemen hebben de voordelen van gemakkelijke manipulatie, hoge transductie efficiëntie, langdurige en robuuste niveaus van meningsuiting, en het vermogen te produceren permanente effecten in vivo. Daarom gebruikt de gene levering systemen met behulp van de retrovirussen, lentivirussen en adenovirussen wijd zijn inmammalian cellijnen en model soorten. Het Sindbis virale expressie systeem had eerder is gebruikt voor het analyseren van de genfunctie in de volwassen mug; Naast de bioveiligheid zorgen is de injectie echter nog steeds een noodzakelijk proces voor virale infectie⁹. Hoewel, de mondelinge levering door inweken larven in de dsRNA oplossing is eerder gemeld als een haalbaar leveringsmethode, is het niet geschikt voor kleine RNA functie-analyse¹⁰. Effectieve virale afleveringsmethoden moeten dus nog worden ontwikkeld voor muggen.

Mosquito densoviruses (MDVs) behoren tot de onderfamilie Densovirinae van Parvoviridae, en alle maar één vallen onder het geslacht Brevidensovirus¹¹. MDV virionen zijn niet-gehuld en bestaan uit een genoom van single-stranded DNA (ssDNA) en een icosahedrale Eiwitmantel (20 nm diameter). Het virale genoom is ongeveer 4 kb in grootte en wordt gerepliceerd binnen de kernen van cellen van de gastheer. MDVs zijn relatief stabiel in de omgeving en een smalle host bereik weergeven met hoge specificiteit voor muggen. Deze virussen hebben het potentieel om te verspreiden en blijven natuurlijk mug populaties en bijna alle organen en weefsels van deze insecten, met inbegrip van de middendarm, Malpighian tubuli vet lichamelijk, de daaraan gehechte spiermassa, neuronen en speekselklieren¹²kunnen binnenvallen.

Intact MDV genomen kunnen worden subcloned in plasmide vectoren te produceren plasmide gebaseerde besmettelijke klonen; Wanneer deze klonen worden afgeleverd in cellen van de mug, het virale genoom wordt gewonnen uit de plasmide vector, en besmettelijke virale deeltjes worden geproduceerd. Omdat MDV een kleine ssDNA genoom heeft, besmettelijke klonen zijn gemakkelijk gebouwd en het virale genoom kunnen gemakkelijk gemanipuleerd^11,,¹³. Deze kenmerken maken MDV een waardevolle agent voor de behandeling van de mug biologie. Echter, omdat bijna alle van het virale genoom is essentieel voor de virale proliferatie, het scheppen van recombinante virus door vervanging of toevoeging van buitenlandse genen veroorzaakt een verlies in virale verpakking en/of replicatie capaciteiten, waardoor een belemmering voor de ontwikkeling van MDVs als gene levering vectoren. Hierin, rapporteren we met behulp van een kunstmatige intronic kleine-RNA expressie-strategie te ontwikkelen van een niet-defecte rAaeDV in vivo RNA bezorgingssysteem dat heeft de voordelen van gemakkelijke plasmide constructie en het onderhoud van een functionele virus dat kan produceren stabiele en lange termijn expressie in gastheer cellen zonder de noodzaak voor wild-type virus. Bovendien, zorgt deze methode voor het gemakkelijk transductie van larven.

De protocollen voor de volgende stappen worden beschreven in deze studie: 1) ontwerp van rAaeDVs een intronic kleine-RNA expressie cassette, 2) de productie van recombinante virusdeeltjes de cel C6/36 verpakking te gebruiken codering lijn, 3) kwantitatieve analyse van cel-vrij rAaeDV genoom kopiëren nummers, en 4) infectie van Ae. albopictus larven door directe invoering van virus in het waterlichaam van de larvale habitat. Globaal, dit werk aangetoond dat specifieke kleine RNAs doelgenen kunnen worden overexpressie of neergehaald in met behulp van het ontwikkelde MDV uitvoeringssysteem muggenlarven.