שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

בעקיצות יתוש מחלות כמו מלריה, קדחת דנגי, קדחת zika, קדחת צהובה, הן בעיות בריאות הציבור הבינלאומיים הגדולים ימשיך להביא בחשבון חלק משמעותי של מחלה זיהומית העולמי נטל^1,2. חומרי הדברה קונבנציונאליים, אשר שימשו בתגובה וקטורים, הם מרכיב מרכזי של קיימא יתושים משולבת אסטרטגיה הבקרה למניעת מחלות בעקיצות יתוש. עם זאת, אסטרטגיות מעין אלו הוכיחו להיות יחסית לא יעילה או לא רצוי בשל את המשויך השפעות סביבתיות שליליות, כמו גם את האבולוציה של עמידות נגד יתושים אוכלוסיות^3,4. מסיבות אלו, יש צורך דחוף שיטות אלטרנטיביות של יתוש שליטה, וכן השימוש בשיטות הטרנסגניים לייצר יתושים זכרים מעוקרים, שחרורו של יתושים פתוגן עמיד שהתעוררו כמו אסטרטגיות שליטה חדש מבטיח. לפתח אפקטיבי חדש לשלוט בשיטות, כגון גישות בטוח ויעיל עבור ויוו המסירה הגן, ניתוח מקיף של יתוש ג’ין פונקציה זו נדרשת.

Microinjection ישירה של פלסמיד ה-DNA, כפול תקועים RNA (dsRNA) או RNA קטנים מפריעות (siRNA) היא הנפוצה ביותר ויוו ג’ין משלוח השיטה יתושים. למעשה, ייצור הטרנסגניים זנים של יתושים עדיין מסתמכים על תהליך של העובר microinjection^5,6,7. עם זאת, microinjection יש מספר מגבלות. ראשית, טכניקה זו הוא תובעני מבחינה טכנית, כרוך פרוצדורות מסובכות. שנית, הזרקת גורם של עלבון פיזית אל העובר, הזחלים, גלמים, מבוגר, אשר משפיע ישירות על הכדאיות של האורגניזם היעד. שלישית, קשה לשתק רימות היתוש עבור microinjection כי רוב לגור גידול מימיים והינם בעלי מאפיין נזחל התנועה. רביעית, בגודל של 1^סנט-2^nd לחלל הזחלים היא 10 – עד 20 פי קטן יותר מזה של 4^th לחלל הזחלים בוגרים, ואת את ציפורנייך של לשעבר הם עדינים יותר. תכונות אלה מקשות לתמרן 1^סנט-2^nd לחלל הזחלים בהשוואה לאלו בשלבים בוגרים. משולב, גורמים אלה תורמים סיכויי הישרדות שלאחר הזרקת מופחת עבור הזחלים (כ- 5%) לעומת מבוגרים⁸. מערכות מבוססות ויראלי משלוח פותחו כדי להתגבר על המחסומים חוץ-תאית, תאיים הקשורים. המערכות הללו יש את היתרונות של טיפול קל, יעילות גבוהה התמרה חושית, לטווח ארוך וחזק רמות ביטוי ביכולתה לייצר תופעות מתמשכות ויוו. לכן, ג’ין מערכות אספקה ניצול רטרווירוסים, lentiviruses ו- adenoviruses היה נרחב בשימוש שורות תאים inmammalian ומינים מודל. מערכת ביטוי ויראלי Sindbis היה בשימוש בעבר כדי לנתח את פונקציית ג’ין היתוש למבוגרים; מלבד החשש אבטחה, הזרקת זאת, עדיין תהליך הכרחי עבור זיהום ויראלי⁹. אמנם, משלוח אוראלי למסמס את הזחלים בפתרון dsRNA דווחה בעבר שיטת משלוח ריאלי, זה מתאים ניתוח פונקציה RNA קטנים¹⁰. אז, יש עדיין לפתח שיטות משלוח ויראלי יעיל ליתושים.

יתוש densoviruses (MDVs) הם חלק תת משפחה Densovirinae Parvoviridae, ונפילתה, כולם בתוך הסוג של Brevidensovirus¹¹. MDV virions שאינו אפוף הינם מורכבים של גנום חד גדילי הדנ א (ssDNA), של capsid icosahedral (20 ננומטר בקוטר). הגנום הנגיפי משוכפל בתוך הגרעינים של התאים המארחים והיא בגודל של-4 kb. MDVs יציבים יחסית בסביבת ולהציג מגוון מארח צר עם ירידה לפרטים גבוה ליתושים. וירוסים אלה יש פוטנציאל התפשטה, מתעקש באופן טבעי אוכלוסיות יתוש, יכול לפלוש כמעט כל איברים ורקמות של חרקים אלה, לרבות פיתול, Malpighian בקוריאנית, שומן הגוף, מערכת השרירים, נוירונים, בלוטות הרוק¹².

הגנום MDV שלם יכול להיות subcloned לתוך פלסמיד וקטורים לייצר שיבוטים זיהומיות המבוסס על פלסמיד; כאשר שיבוטים אלה מועברים לתאים יתושים, הגנום הנגיפי מופק מן הווקטור פלסמיד, נגיפים זיהומיות מיוצרים. מכיוון MDV יש גנום קטן ssDNA, שיבוטים זיהומיות נבנות בקלות וניתן הגנום הנגיפי בקלות בעורמה^11,13. מאפיינים אלה להפוך MDV סוכן יקר לבחינת ביולוגיה נגד יתושים. עם זאת, כי כמעט את כל רצף הגנום הנגיפי חיונית עבור הפצה ויראלית, היצירה של וירוס רקומביננטי באמצעות החלפת או החדרת גנים זרים גורמת הפסד יכולות אריזה ו/או שכפול ויראלי, אשר יוצר מכשול להתפתחות של MDVs כמו ג’ין משלוח וקטורים. במסמך זה, אנחנו מדווחים באמצעות אסטרטגיית מלאכותי ביטוי קטן-RNA intronic לפתח מפורמטת rAaeDV ויוו RNA משלוח מערכת בעלת היתרונות של בנייה קלה פלסמיד ותחזוקה של וירוס פונקציונלי יכול לייצר ביטוי ארוכות טווח ויציבה בתאי המארח ללא צורך פראי-סוג וירוס. בנוסף, שיטה זו מאפשרת התמרה חושית קל של הזחלים.

הפרוטוקולים עבור השלבים הבאים מתוארים במחקר זה: שורה 1) העיצוב של rAaeDVs קידוד של קלטת ביטוי קטן-RNA intronic, 2) לייצור חלקיקי וירוס רקומביננטי שימוש בתא C6/36 אריזה, 3) ניתוח כמותי של התא-חופשית הגנום rAaeDV להעתיק מספרים ו- 4) זיהום של Ae. albopictus הזחלים על ידי ישיר החדרת וירוס לתוך הגוף מים של הגידול הזחל. בסך הכל, עבודה זו הוכיחה כי RNAs קטן מסוים או גנים היעד שניתן overexpressed או הפיל ב הזחלים יתושים באמצעות מערכת מפותחת של משלוח MDV.