細胞内の内腔の形態形成と単一細胞におけるIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫排泄管: GFP 融合、RNAi 操作画面やイメージングによるラベリング
Summary
線虫 c. エレガンスの排泄管はde novo偏光膜生合成の視覚的生体内解析のためのユニークな単一細胞モデルです。このプロトコルでは、標準的な遺伝学的/RNAi とアプローチ、同定と解析分子単細胞 tubulogenesis と頂端膜と内腔を演出するための適応をイメージングの組み合わせについて説明します。
Abstract
4 つのc. の elegans排泄管が狭い管とほぼ同等にまで拡張の細胞内 endotubes を構築し、膜と submembraneous ルーメンの安定化の 1 つのセルから動物の長さまで延長根尖部の文字の骨格。排泄の細胞拡大その長さ約 2,000 倍・ デ ・ ノボ偏光膜器官、細胞内腔の形態形成の生体内評価のためユニークなこのモデルを作るこれらの運河を生成して単細胞tubulogenesis。ここで提示されたプロトコルは、標準のラベル付け、利得と損失-の機能遺伝子や RNA 干渉 (RNAi) を結合する方法を示しています-とこのモデルを使用して視覚的に解剖し、機能分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ。ラベルをつける方法の例としては、プロトコルは、tubulogenesis のライブ解析用蛍光融合タンパク質を持つトランスジェニック動物の世代をについて説明します。遺伝的アプローチの例としてそれは利得関数の嚢胞性の管の表現型を変更するのには設計されています visual RNAi ベース対話画面の重要なポイントを強調表示します。説明する方法がどのようにする: ラベルし、蛍光蛋白質を表現することによって運河を可視化対象となる RNAi ライブラリを構築し、RNAi スクリーニング運河の形態形成の分子分析のための戦略を練る運河の表現の変更を視覚的に評価します。蛍光顕微鏡の解剖によってそれらを獲得します。共焦点顕微鏡から高い解像度で細胞レベル下の運河のコンポーネントを特徴します。視覚パラメーターを定量化します。アプローチは調査官と遺伝子細胞内腔の系統保存のプロセスに関与する、単細胞を定量化のc. の elegans排泄管の活用に興味のある人の役に立つ管形成。
Introduction
すべての臓器は、チューブ、輸送、ガス、液体、栄養素の交流と老廃物の排泄などの彼らの多くの異なる機能のために重要ので構成されます。異なる腔と頂端膜の偏光文字はこれらの特定の機能に適応、遠藤・膜システムの器官の欠陥人間の病気1,2が頻繁に発生。管血管・臓器の大半は多細胞と、内腔を形成する intercellularly;ただし、単細胞のチューブ内腔を細胞内に形成することができます、人間の毛管ベッド2の 30-50% と同じくらい表すなど。マルチと単細胞チューブの偏光膜のミクロ相分離構造は管の特定の機能 (例えば、線虫の腸絨毛と排泄管細管に基づいて異なる場合がありますが構成で類似しています。線虫;c. の elegans腸 tubulogenesis の紙を伴う参照)3。偏光膜生合成と tubulogenesis の原則は、後生動物の間で維持され、類似分子機械は1,2,4を導きます。
線虫 c. エレガンスの排泄システムは、5 つのセルで構成されています: 排泄細胞 (EC)、管細胞 (DC)、細孔セル (PC) と 2 つの腺細胞。EC、DC、または PC のアブレーションは、体腔と初期の幼虫のステージ5で、動物が死亡の体液貯留を引き起こします。興味を持って、これらの 3 つの単細胞の管は 3 つの異なる方法でそのルーメンを作成: 細胞 (EC) を空洞化。セルの折り返し結合 autocellular 接合の形成 (PC);セルの折り返しによって autofusion (DC); と相まって、すべての系統保存6,7は、内腔の形態の異なるメカニズム。後部咽頭電球の左の側面に位置する EC を送信 2 つ横の拡張 4 つの運河が前方を拡張する進出するからと後方 (両方の左右側) にワームの鼻と尻尾の先端に、それぞれ (図 1)5,6,8。EC は、それに動物の最大のセル 2 x 1,000 μ m に約 1 μ m から延びて.細胞内レベル排泄管基底膜、pseudocoelom に向けて、内腔の膜 (endotube) によるトンネルから生成された、シンプルなチューブです。そののみ細胞間のジャンクション; 管腔膜に接続する管腔膜運河は、それ以外の場合 (図 1) の長さに沿って junctionless。アピカル膜の組成と、腸管などの多細胞管の submembraneous 骨格のような分子構成によって定義された、排泄管腔膜とその submembraneous 骨格が頂、その他 (例えば、フラット) 上皮細胞の。細胞質細胞器官、エンドソーム小胞およびその他 (例えばゴルジ) 運河の長さに沿って分布している膜を含みます。さらに、複数の小管小胞の内腔の膜に接続または相互接続、または分離 – 運河細胞質7,8,9,10 通したか.この動的プラズマ膜/小管接続はさらに運河の膜システムを展開し、形態形成と浸透圧10をルーメンと両方に貢献します。排泄の運河従ってほぼ完全に遠藤と原形質膜、偏光膜生合成の解析と遠藤-膜インターフェイスへの調節のエクセレント モデルを提供することで構成されます。内腔拡張-と一致する単一細胞システム – 運河の形態形成における頂端膜の劇的な拡張も安定化し、細胞内腔側膜を中心に必要性によって生じる建築の問題を分析することができます。.このプロトコルは、EC の位置を生成する細胞の運動を直接信号ではなく管チューブとルーメンの構造形態の創生とこのプロセスに必要な細胞内膜動態の解析に焦点を当てて、排泄システム (文献6) 他の細胞成分との複雑な接続を構築します。
偏光膜と内腔の細胞内器官の分析のためc. の elegans単一セル管システムのそれ以上の利点は発達の時間を通じて、その膜のさまざまなコンポーネントの生成を分離する能力接合します。EC は腹側の閉鎖の時間に生まれ、半ば胚5,6,8延長横方向の運河と分岐が発生する期間中に、咽頭の頬骨横方向に落ち着きます。これが前後運河拡張後期胚形成、L1 – 幼虫 (図 1) に続くプロセス中に続きます。孵化幼虫で後部運河先端にワームのほぼ真ん中、ワーム8と共に延長完全に伸びる尾 L1 ステージの終わり時間後運河。従って動物の成長を上回る速度でアクティブな運河成長終了最初の幼虫の段階で、しかし、さらに成長は、追加幼虫段階 (L2-4) で全体の動物の成長と並行して行われます。この設定は、偏光の細胞分裂または移行の独立したde novo偏光膜器官の異なるステップを分析する機会を提供します。さらに、それは (ルーメン開始前に胚発生) する接合のアセンブリからこのプロセスの分離を許可します。膜の分極を彼らの正確な要件はまだ極性において未解決の問題です。最後に、それは一意に基底膜の拡張、後者の過程は排泄管10の元の前から頂分離します。線虫 c. エレガンスの排泄管モデルが偏光膜生合成の分析のためのこれらの利点の多数を共有するが、多細胞の設定 (参照の実行腸管モデルに特に有益な補完それに伴う紙腸 tubulogenesis3)。
そのルーメンが vi をすることができますこの小さなワームの極薄の細管が野生型運河、この透明な動物にノマルスキー光学系による直接 sualized。実際には、変異の嚢胞性の管の形態解剖顕微鏡前方遺伝スクリーンで大きな効果を tubulogenesis11に関与する遺伝子を識別するために使用されている低倍率を使用してラベルのない動物で特徴付けられます。運河の形態とその偏光膜、骨格成分、異なる細胞内小器官、他の細胞レベル下の構造の違いの改善された可視化ラベリングが必要ですし、高い電力蛍光解離および共焦点の顕微鏡検査。運河の微細構造は、ラベリングと顕微鏡のための困難の数ポーズ、各コンパートメントに固有の特定の分子を介して膜と細胞レベル下のコンポーネントを区別できるし、動物が安全に場合は、マウント顕微鏡用特定のアーティファクト (プロトコルおよび議論を参照) を導入することを避けるために予防措置を。ラベリングを行う固定標本の免疫組織化学によってまたは彼らの自身の制御の下で蛍光融合蛋白質を表現する遺伝子組換えのワームを生成することによってまたは生体内イメージングの排泄管特異的発現プロモーター。このプロトコルを記述する後者のラベリング手法 (抗体染色3腸 tubulogenesis の付属の紙を参照)。
生体内でイメージ投射単一細胞解析と体内の損失または利得-の機能研究を結合する能力はc. の elegansの排泄管分子に特に強力なモデル開発作る全体レベルと単細胞の tubulogenesis の細胞の解析。運河の形態表現型 (例えば、嚢胞) を識別するために野生型またはラベル付けの遺伝子組換え動物から始まる前方または逆引き遺伝子スクリーニングを行うことが、その基になる遺伝子欠陥。また、このような画面 (例えば、嚢胞性の管) の突然変異形質を開始し、抑制やエンハンサーこの表現型の突然変異体の表現型の原因遺伝子をもつ遺伝子機能的相互作用を識別する識別。突然変異体の表現型を引き起こす遺伝的欠陥は、(例えば遺伝子の欠失を経由) の損失または利得を引き起こすことができる (例えば、を介して活性化突然変異か余分な遺伝子のコピーの導入を通した) 調査関数の。前方変異または体系的な RNAi 画面は遺伝子機能に先入観なしであり、公平な関心の機能に関与する遺伝子同定を許可します。ゲノムワイド RNAi ライブラリを供給の可用性、与えられたほとんどすべての遺伝子を簡単に倒す方法線虫、RNAi による興味の単一の遺伝子または遺伝子 (例えば、対象となる画面) のグループも急速に検出できるように逆遺伝学アプローチの影響。アプローチの可能な組み合わせを示すためには、ここで述べる対象 RNAi 操作画面では、機能獲得の嚢胞性の排泄管の突然変異から始まる細胞質管緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いた。突然変異体の表現型は、 erm 1、非常に節約された線虫の過剰発現によって生成された膜アクチン リンカー家族・ エズリン ラデキシン モエシン (ERM) は、膜と内腔の形態形成に関与しているのオーソログ多くの種12組織。C. の elegans ERM 1 排泄管や腸などの内臓の内腔の膜に局在する、両方の13の管腔形成に必要です。ERM 1 過剰発現は、余分なアクチンおよび管の内腔側膜内腔量の増加、短い嚢胞性の管と肥厚したアクチン下塗り9圧着内腔の膜を生成する小胞を募集します。プロトコルは、融合蛋白質 (または他の蛋白質) というラベルの付いた排泄運河発現トランスジェニック系統を生成する方法をについて説明しますこのようなひずみは、運河の表現型; の修飾子を識別するで始まるターゲットの RNAi 画面を実行する方法有益な tubulogenesis の表現型を定量化するための簡単な方法を含め、蛍光解離性と共焦点顕微鏡によるこのような画面の結果を視覚的に分析する方法。腸 tubulogenesis3に付属の紙の代わりにラベリング技術および RNAi、しばしば致命的な tubulogenesis 遺伝子の調整の詳細を見つけることができます。すべてのメソッドは、運河 tubulogenesis の他の質問の調査のためのさまざまな組み合わせで使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
線虫の遺伝的多様性、透明性、シンプルなボディ計画、不変の細胞系譜が形態形成の解析のための優れたモデルを作る。このプロトコル記述する標準的な遺伝的操作とイメージングを組み合わせる方法を 2 ミクロンの活用研究薄い偏光膜と単一細胞管の内腔の細胞内器官を検討する線虫排泄運河。
ラベリング
ライブ解析 (ここを参照)、許可?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は感謝 m. ビュークナー (カンザス大学、カンザス、米国)、k. Nehrke (ロチェスター大学医療センター、ロチェスター、ニューヨーク、米国)、および健康の国民の協会、事務所の研究基盤出資線虫遺伝学センタープログラム (P40 OD010440)。この作品は、英領バージン諸島に SAA 223809、MGH は 224570 NIH の GM078653 の助成金によって支えられました。
Materials
| Cloning | |||||
| Plasmid pPD95.75 | Addgene | Cat. No. 37464 | |||
| PCR Kit | Qiagen | Cat. No. 27106 | |||
| Ligation kit | New England Biolabs | Cat. No. E2611L | |||
| DNA marker | Thermo Scientific | Cat. No. SM1331 | |||
| Agarose DNA grade | Fisher Scientific | Cat. No. BP164-100 | |||
| Competent cells | New England Biolabs | Cat. No. C2987H | |||
| Tris | Fisher Scientific | Cat. No. BP154-1 | |||
| EDTA | Sigma | Cat. No. ED-1KG | |||
| Acetic acid | Fisher Scientific | Cat. No. A38S-500 | |||
| Ethidium bromide | Fisher Scientific | Cat. No. BP1302-10 | |||
| Equipments | |||||
| PCR machine | MJ Research | Cat. No. PTG-200 | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Cat. No. 5415C | |||
| Water Bath | Precision Scientific | Cat. No. 666A3 | |||
| Gel running instrument | Fisher Scientific | Cat. No. 09-528-165 | |||
| Gel running power supply | Fisher Scientific | Cat. No. 45-000-465 | |||
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | Cat. No. 1708195EDU | |||
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Cat. No. ND1000 | |||
| C. elegans related1 | 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures. | ||||
| LB Medium and plates2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Yeast Extract | BD Biosciences | Cat. no. 212750 | |||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| Ampicillin | Sigma | Cat. no. A0116 | |||
| Tetracycline | Fisher Scientific | Cat. no. BP912 | |||
| M9 Medium2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| Na2HPO4 | Sigma | Cat. no. S7907 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| NGM plates 2 | 2see reference24 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| RNAi plates3 | 3see reference60 for protocols. | ||||
| NaCl | Sigma | Cat. no. S7653 | |||
| Peptone | BD Biosciences | Cat. no. 211677 | |||
| Tryptone | Acros Organics | Cat. no. 611845000 | |||
| Bacto Agar | BD Biosciences | Cat. no. 214040 | |||
| MgSO4 | Sigma | Cat. no. M2773 | |||
| CaCl2 | Sigma | Cat. no. C3881 | |||
| Cholesterol | Sigma | Cat. no. C8667 | |||
| K2HPO4 | Sigma | Cat. no. P3786 | |||
| KH2PO4 | Sigma | Cat. no. P0662 | |||
| IPTG | US Biological | Cat. no. I8500 | |||
| Carbenicillin | Fisher Scientific | Cat. no. BP2648 | |||
| NaOH | Fisher Scientific | Cat. no. SS266-1 | |||
| Sodium hypochlorite | Fisher Scientific | Cat. no. 50371500 | |||
| Bacteria | |||||
| OP50 bacteria | CGC | ||||
| HT115 bacteria | CGC | ||||
| Genome-wide RNAi libraries | |||||
| Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) | Source BioScience | ||||
| C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) | Source BioScience | ||||
| Imaging related | |||||
| Lidocaine | MP Biomedicals,LLG | Cat. no. 193917 | |||
| Materials | |||||
| Vacuum Grease Silicone | Beckman | Cat. no. 335148 | |||
| Microscope slides | Fisher Scientific | Cat. no. 4448 | |||
| Microscope coverslips (22×22-1） | Fisher Scientific | Cat. no. 12-542-B | |||
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Inc. | Cat. no. 08-772-33 | |||
| Equipment | |||||
| SMZ-U dissecting microscope (Nikon) | |||||
| SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions). | |||||
| TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem) | |||||
| C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon) | |||||
References
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