Het kanaal Excretory C. elegans als een Model voor de intracellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van organellen in één cel: labelen door GFP-fusies, RNAi interactie scherm en beeldvorming

Alle interne organen zijn samengesteld uit buizen, cruciaal zijn voor hun vele verschillende functies, zoals het vervoer, de uitwisseling van gassen, vloeistoffen en voedingsstoffen en de uitscheiding van metabolische afval. Hun gepolariseerde karakter, met duidelijke apicale en lumenal membranen, is aangepast aan deze specifieke functies, en gebreken in de biogenese van hun systemen voor endo- en plasmamembraan zijn een frequente oorzaak van ziekten bij de mens^1,2. De meerderheid van de buizen van de therapieën en inwendige organen zijn meercellig en vormen een lumen intercellularly; echter, eencellige buizen, die het lumen intracellulair vormen, kunnen, bijvoorbeeld, zo veel als 30-50% van de menselijke capillair bedden²vertegenwoordigen. De gepolariseerde membranen van multi- en eencellige buizen zijn qua samenstelling, hoewel hun microdomains op basis van de specifieke functie van de buis (bijv., uitscheidingsmechanisme kanaal canaliculi versus intestinale microvilli in Caenorhabditis verschillen kunnen elegans; Zie bijbehorende papier op C. elegans intestinale tubulogenesis)³. Bewaring van de beginselen van biogenese van gepolariseerde en tubulogenesis worden toegepast onder metazoans, en een soortgelijk moleculaire machines dirigeert ze^1,2,4.

Het uitscheidingsmechanisme systeem van C. elegans bestaat uit vijf cellen: de uitscheidingsmechanisme-cel (EG), koker cel (DC), porie cel (PC) en twee cellen van de klier. Ablatie van de EG, DC of PC zorgt ervoor dat vocht ophoping in de lichaamsholte en het sterven van de dieren op een vroege larvale stadium⁵. Intrigerend, deze drie eencellige buizen maken hun lumen op drie verschillende manieren: door cel uitholling (EG); cel inwikkeling in combinatie met autocellular junction vorming (PC); en door cel inwikkeling in combinatie met autofusion (DC); verschillende mechanismen van lumen morfogenese die alle fylogenetisch geconserveerde^6,7. De EG, gelegen aan de linker laterale kant van de posterieure faryngaal lamp, stuurt twee zijdelingse extensies uit die de vier grachten uit te breiden anteriorly tak en posteriorly (aan de rechter en linker kant) naar het uiteinde van de van de worm neus en staart , respectievelijk (Figuur 1)^5,6,8. De EG strekt zich uit van ongeveer 1 µm tot 2 x 1.000 µm, waardoor het de grootste cel van het dier. Op een subcellular niveau is het uitscheidingsmechanisme kanaal een eenvoudige buis, gegenereerd op basis van een basale membraan gericht op de pseudocoelom en tunnel door een lumenal membraan (endotube). Het kanaal lumenal membraan verbindt aan de buis lumenal membraan zijn alleen intercellulaire afslag; de grachten zijn anders junctionless langs hun lengte (Figuur 1). Het uitscheidingsmechanisme kanaal lumenal membraan en haar submembraneous cytoskelet zijn apicaal, gedefinieerd door hun moleculaire compositie die lijkt op de samenstelling van de apicale membraan en submembraneous cytoskelet van meercellige buizen, zoals de darm, en van andere epitheel (bijvoorbeeldplat). Cytoplasmatische organellen, met inbegrip van endosomal vesiculaire en andere (bijvoorbeeldGolgi) endomembranes zich langs de lengte van het kanaal bevinden. Daarnaast zijn meerdere canalicular blaasjes – verbonden met het lumenal membraan, en/of onderling verbonden of geïsoleerd – threaded via het kanaal cytoplasma^7,8,9,10 . Deze dynamische plasma-membraan/canalicular verbinding verder van het kanaal membraan systeem breidt en draagt bij aan beide lumen genuitdrukking en osmoregulatie¹⁰. Het uitscheidingsmechanisme kanaal bestaat dus bijna volledig van endo- en plasma membranen, bieden een uitstekend model voor de analyse van gepolariseerde biogenese en de regulering van de endo-aan plasmamembraan interface. De dramatische uitbreiding van de apicale membraan tijdens kanaal morfogenese – in dit samenvallen met lumen extensie – eencellige-systeem maakt het ook mogelijk om te analyseren de architecturale problemen die ontstaan door de noodzaak te stabiliseren en centreren van een intracellulaire lumenal membraan . Dit protocol is gericht op de analyse van de kanaal buis van en lumen van structurele genuitdrukking en de dynamiek van de intracellulaire membraan vereist voor dit proces in plaats van op de signalen die direct van de bewegingen van de cel die het genereren van de EG positie in de uitscheidingsmechanisme systeem en de ingewikkelde verbindingen met andere cellulaire elementen (herzien in⁶) op te bouwen.

Een ander voordeel van de C. elegans eencellige kanaal systeem voor de analyse van gepolariseerde membraan en intracellulaire lumen biogenese is haar vermogen om te scheiden, door de ontwikkelings tijd, de generatie van verschillende onderdelen van de membranen en kruispunten. De EG is geboren op het moment van sluiting van de ventrale en regelt ventro-lateraal van de keelholte tijdens mid embryogenese^5,6,8, waarin verlenging van de laterale kanaal en vertakking voordoet. Dit wordt gevolgd door anterior-posterior kanaal extensie tijdens late embryogenese, een proces dat in de L1-larvale stadium (Figuur 1 blijft). In een onlangs uitgekomen larve, de tip van achterste kanaal bereikt ongeveer het midden van de worm, samen met de worm⁸volledig uit te breiden tot de staart aan het einde van de etappe van L1, waarna het kanaal kieuwopeningenvorm. Actieve kanaal groei op een maximumsnelheid van meer dan die van de groei van het dier dus eindigt bij het eerste larvale stadium, echter, verdere groei gebeurt parallel met de groei van het hele dier tijdens de extra larvale stadia (L2-4). Deze instelling biedt de mogelijkheid om te analyseren verschillende stappen van DOVO gepolariseerde biogenese onafhankelijk van gepolariseerde celdeling of migratie. Bovendien, het maakt het mogelijk de scheiding van dit proces van de vergadering van kruispunten (die voorkomen in het embryo voordat lumen Inleiding); hun exacte behoefte in membraan polarisatie is nog steeds een open vraag op het gebied van de polariteit. Ten slotte, het unieke scheidt apicale van basale membraan expansie, het laatste proces voorafgaat aan de voormalige in de uitscheidingsmechanisme grachten¹⁰. De C. elegans uitscheidingsmechanisme kanaal model is dan ook een bijzonder informatief aanvulling op de intestinale model dat deelt een aantal van deze voordelen voor de analyse van gepolariseerde biogenese maar wordt het uitgevoerd in een meercellig instelling (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis³).

Hoewel wild-type kanalen uiterst dunne buisjes in deze kleine worm zijn, kunnen hun lumen visualized direct door Nomarski optica in dit transparante dier. Mutant cystic kanaal morphologies kunnen in feite worden gekarakteriseerd in labelloze dieren met behulp van lage vergroting ontrafeling van microscopie, die te groot effect in voorwaartse genetische schermen is gebruikt om genen die betrokken zijn bij tubulogenesis¹¹te identificeren. Verbeterde visualisatie van de morfologie van grachten en onderscheid van hun gepolariseerde membranen, cytoskeletal onderdelen, verschillende intracellulaire organellen en andere subcellular structuren, echter, vereist labeling en hoger macht TL ontleden en confocal microscopie. Hoewel de grachten fijne structuur een aantal moeilijkheden voor het benoemen en microscopie vormt, membranen en subcellular onderdelen via de specifieke moleculen die uniek zijn voor elk compartiment kunnen worden onderscheiden, en dieren kunnen worden veilig gemonteerd voor microscopie als bepaalde voorzorgsmaatregelen worden genomen om te voorkomen dat de invoering van artefacten (Zie Protocol en discussie). Etikettering kan worden gedaan door immunohistochemistry in vaste specimens, of door het genereren van transgene wormen uiting van fluorescerende fusion eiwitten onder de controle van hun eigen of uitscheidingsmechanisme kanaal-specifieke initiatiefnemers voor in vivo imaging. Dit protocol beschrijft de laatste labeling techniek (Zie het begeleidende document op intestinale tubulogenesis voor antilichaam³kleuring).

De mogelijkheid om te combineren in vivo – of winst-van-verliesfunctie studies met in vivo imaging analyse op de eencellige niveau in de gehele ontwikkeling maakt het uitscheidingsmechanisme kanaal van C. elegans een bijzonder sterke model voor de moleculaire en cellulaire analyse van eencellige tubulogenesis. Forward of reverse genetische schermen kunnen worden uitgevoerd vanaf een wild-type of gelabelde transgene dieren te identificeren kanaal morfogenese fenotypen (bijvoorbeeld cysten) en hun onderliggende genetische defecten. Als alternatief, dergelijke schermen kunnen beginnen met een mutant fenotype (bijvoorbeeld, een cystic kanaal) en identificeren van suppressors of versterkers van dit fenotype ter identificatie van genen die functioneel interactie met de gen veroorzaakt het mutant fenotype. Het genetische gebrek dat veroorzaakt het mutant fenotype een verlies (bijvoorbeeld, via de schrapping van de gene) of een winst kan veroorzaken (bijvoorbeeld via een activerend mutatie of via de invoering van overtollige gene kopieën) van de onderzochte functie. Voorwaartse mutagenese of systematische RNAi schermen zijn zonder vooroordelen op genfunctie en toestaan dat de onbevooroordeelde identificatie van genen die betrokken zijn in de functie van belang. Gezien de beschikbaarheid van genoom-brede RNAi voederen van Bibliotheken, kan bijna elk gen worden gemakkelijk neergeslagen door RNAi in C. elegans, zodanig dat enkel gen van belang of een andere groep van genen (bijvoorbeeldin gerichte schermen) kan ook worden snel gesondeerd voor hun effect in de benadering van een omgekeerde genetica. Om aan te tonen een mogelijke combinatie van benaderingen, hier beschrijven we een gerichte RNAi interactie scherm, beginnend met een winst-of-function cystic uitscheidingsmechanisme kanaal mutant, aangeduid met de cytoplasmatische kanaal groen fluorescente proteïne (GFP). De mutant fenotype werd gegenereerd door overexpressie van erm-1, een zeer geconserveerde C. elegans ortholog uit de linker membraan-actine Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), die is betrokken bij lumen genuitdrukking en membraan organisatie in vele soorten¹². C. elegans ERM-1 lokaliseert te lumenal membranen van inwendige organen, zoals de uitscheidingsmechanisme kanaal en de darm, en is vereist voor lumen vorming in beide¹³. ERM-1 overexpressie werft overtollige actine en blaasjes aan de gracht lumenal membraan, verhoging van de flux in de lumen en het genereren van een kort cystic kanaal en een gekruld lumenal membraan met verdikte actine ondervacht⁹. Het protocol wordt beschreven hoe u voor het genereren van transgene variëteiten met uitscheidingsmechanisme-kanaal-uitgedrukt label fusion eiwitten (of andere eiwitten); het uitvoeren van gerichte RNAi schermen beginnen met dergelijke stammen, te identificeren van de parameters van het fenotype van een kanaal; en hoe te visueel analyseren de resultaten van dergelijke schermen door fluorescentie ontleden en confocal microscopie, met inbegrip van eenvoudige manieren om te kwantificeren informatieve tubulogenesis fenotypen. Alternatief labeling technieken en de details van RNAi, aangepast aan de vaak dodelijke tubulogenesis genen, kan worden gevonden in het begeleidende document op intestinale tubulogenesis³. Alle methoden kunnen worden gebruikt in verschillende combinaties voor het onderzoek van andere vragen over kanaal tubulogenesis.