Il canale di Excretory c. elegans come un modello per intracellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo in una singola cella: etichettatura di GFP-fusioni, schermata di interazione di RNAi e Imaging

Tutti gli organi interni sono composti da tubi, cruciale per loro molte funzioni diverse, come ad esempio il trasporto e scambio di gas, liquidi e sostanze nutritive e l’escrezione dei rifiuti metabolici. Loro carattere polarizzato, con membrane apicali e lumenal distinte, è adattato a queste specifiche funzioni, e difetti nella biogenesi dei loro sistemi endo – e della membrana plasmatica sono una causa frequente di malattia umana^1,2. La maggior parte dei tubi del sistema vascolare e degli organi interni è pluricellulare e forma un lume intercellularmente; Tuttavia, tubi unicellulari, che formano il lume intracellulare, possono, ad esempio, rappresentare tanto quanto 30 – 50% dei letti capillari umano². Le membrane polarizzate di multi – e tubi unicellulari sono simili nella composizione, anche loro microdomini possono differire in base alla funzione specifica del tubo (ad es., canaliculi canale escretore contro i microvilli intestinali in Caenorhabditis elegans; Vedi che accompagna il libro su c. elegans intestinale tubulogenesis)³. I principi della biogenesi della membrana polarizzata e tubulogenesis sono conservati tra i metazoi, e un simile macchinario molecolare li dirige^1,2,4.

Il sistema escretore di c. elegans è costituito da cinque celle: poro escretore delle cellule (CE), delle cellule del condotto (DC), cellulare (PC) e due cellule della ghiandola. Ablazione del CE, DC o PC provoca l’accumulo di liquidi nella cavità del corpo e animali muoiono un precoce stadio larvale di⁵. Curiosamente, questi tre tubi unicellulari creano loro lumi in tre modi diversi: dalla cella di vuotatura (CE); avvolgimento di cellulare accoppiato con formazione di giunzione di autocellular (PC); e avvolgendo cellulare accoppiato con autofusion (DC); diversi meccanismi della morfogenesi lumen che sono tutti filogeneticamente conservate^6,7. La CE, situata sul lato sinistro laterale del bulbo pharyngeal posteriore, manda due estensioni laterali da cui si diramano i quattro canali estendere anteriormente e posteriormente (su entrambi i lati destro e sinistro) per la punta del naso del verme e coda , rispettivamente (Figura 1)^5,6,8. La CE si estende da circa 1 µm a 2 x 1.000 µm, rendendo la cellula più grande nell’animale. A livello subcellulare, il canale escretore è un semplice tubo, generato da una membrana basale diretto verso il pseudocoelom e incanalato da una membrana di lumenal (endotube). La membrana di lumenal canal si connette alla membrana lumenal condotto alla sua giunzione solo intercellulare; i canali sono altrimenti junctionless lungo la loro lunghezza (Figura 1). La membrana di lumenal canale escretore e sua submembraneous citoscheletro sono apicali, definito dalla loro composizione molecolare che ricorda la composizione della membrana apicale e citoscheletro submembraneous di tubi pluricellulari, come l’intestino, e di altri epiteli (ad es., piatto). Organelli citoplasmici, tra cui endosomal vescicolare e altri (ad es., Golgi) livello delle endomembrane è distribuiti lungo la lunghezza del canale. Inoltre, più vescicole canalicular – collegato alla membrana lumenal, e/o interconnessi o isolato – sono filettate attraverso il canale citoplasma^7,8,9,10 . Questa connessione dinamica del plasma-membrana/canalicular ulteriormente espande il sistema a membrana del canale e contribuisce a entrambi di morfogenesi e osmoregolazione del lume¹⁰. Il canale escretore pertanto costituito quasi interamente endo – e membrane plasmatiche, fornendo un eccellente modello per l’analisi della biogenesi della membrana polarizzata e la regolazione della endo-all’interfaccia della membrana plasmatica. La drammatica espansione della membrana apicale durante la morfogenesi di canal – in questo sistema di cella singola coincida con estensione lumen – permette anche di analizzare i problemi architettonici derivanti dalla necessità di stabilizzare e centrare una membrana di lumenal intracellulare . Questo protocollo si concentra sull’analisi della morfogenesi strutturale di canale tubo e di lumen e le dinamiche di membrana intracellulare necessarie per questo processo, piuttosto che sui segnali che indirizzano i movimenti delle cellule che generano la posizione della CE nella sistema escretore e costruire i suoi intricati collegamenti ad altri elementi cellulari (rivisto in⁶).

Un ulteriore vantaggio del sistema di c. elegans unicellulare canal per l’analisi della membrana polarizzata e biogenesi lumen intracellulare è la sua capacità di separare, nel tempo inerente allo sviluppo, la generazione delle diverse componenti della sue membrane e giunzioni. La CE è nato al momento della chiusura ventrale e si deposita ventro-laterale della faringe durante metà embriogenesi^5,6,8, durante il quale si verificano tempo canale laterale estensione e ramificazione. Questo è seguito dall’estensione antero-posteriore canale durante l’embriogenesi tardiva, un processo che continua nella fase L1-larvale (Figura 1). In una larva appena schiusi, la punta posteriore del canale raggiunge circa la metà del worm, completamente estendere a coda alla fine della fase L1, dopo di che il canale si allunga con il verme⁸. Crescita attiva canale ad una velocità superiore a quella della crescita dell’animale così si conclude la prima fase larvale, tuttavia, ulteriore crescita avviene in parallelo con la crescita dell’intero animale durante gli stadi larvali aggiuntive (L2 – 4). Questa impostazione offre l’opportunità di analizzare diversi passaggi della biogenesi di membrana de novo polarizzata indipendente di divisione delle cellule polarizzata o migrazione. Inoltre, permette la separazione di questo processo dall’assemblaggio di raccordi (che si verificano nell’embrione prima dell’inizio di lumen); loro esigenza esatta nella polarizzazione di membrana è ancora una questione aperta nel campo di polarità. Infine, si separa in modo univoco apicale dall’espansione di membrana basale, il processo di quest’ultimo precede l’ex nei canali escretori¹⁰. Il modello di canale escretore elegans del c. è quindi un complemento particolarmente istruttivo al modello intestinale che condivide un certo numero di questi vantaggi per l’analisi della biogenesi della membrana polarizzata, ma viene eseguito in un ambiente multicellulare (Vedi il libro d’accompagnamento sul tubulogenesis intestinale³).

Anche se selvaggio-tipo canali sono tubuli ultrasottili in questo minuscolo verme, loro lumi possono essere visualized direttamente dall’ottica di Nomarski in questo animale trasparente. Infatti, morfologie mutante canale cistico possono essere caratterizzate in animali senza etichetta usando l’ingrandimento basso microscopia, che è stato utilizzato con grande efficacia in avanti schermi genetici per identificare i geni coinvolti nella tubulogenesis¹¹di dissezione. Visualizzazione migliore della morfologia dei canali e distinzione delle loro membrane polarizzate, componenti citoscheletriche, diversi organelli intracellulari e altre strutture subcellulari, tuttavia, richiede etichettatura e maggiore potenza fluorescenti microscopia confocale e dissezione. Anche se la struttura fine dei canali pone una serie di difficoltà per l’etichettatura e la microscopia, membrane e componenti sottocellulari possono essere distinto tramite le molecole specifiche univoche per ogni vano, e gli animali possono essere montati in modo sicuro per microscopia se alcune precauzioni per evitare di introdurre artefatti (Vedi protocollo e discussione). Etichettatura può essere fatto mediante immunoistochimica nei campioni fissati, o generando vermi transgenici che esprimono le proteine di fusione fluorescenti sotto il controllo dei loro propri o escretori canal specifici promotori per l’imaging in vivo . Questo protocollo descrive la seconda tecnica di etichettatura (Vedi il documento di accompagnamento il tubulogenesis intestinale per anticorpo che macchia³).

La capacità di combinare in vivo studi perdita o guadagno di funzione con in vivo imaging analisi a singola cella di livello in tutto lo sviluppo rende il canale escretore di c. elegans un modello particolarmente forte per il molecolare e analisi cellulare del tubulogenesis unicellulari. Marcia avanti o retromarcia schermi genetici possono essere eseguiti a partire con un animale transgenico wild-type o con etichettato per identificare il canale morfogenesi fenotipi (per esempio, cisti) e loro difetti del gene sottostante. In alternativa, tali schermi possono iniziare con un fenotipo mutante (ad esempio, un canale cistico) e identificare soppressori o esaltatori di questo fenotipo per identificare i geni che interagiscono funzionalmente con il gene che causa il fenotipo mutante. Il difetto genetico che causa il fenotipo mutante può indurre una perdita (ad es., tramite omissione del gene) o un aumento (ad es., tramite una mutazione d’attivazione o tramite l’introduzione di copie del gene in eccesso) della funzione oggetto dell’inchiesta. Trasmettere la mutagenesi o RNAi sistematica schermi senza preconcetti sulla funzione del gene e permettano l’identificazione imparziale di geni coinvolti nella funzione di interesse. Data la disponibilità di RNAi genoma librerie di alimentazione, quasi ogni gene può essere facilmente abbattuto da RNAi in c. elegans, tale che ogni singolo gene di interesse o qualsiasi gruppo di geni (ad es., nelle schermate mirati) anche può essere rapidamente sondato per il loro effetto in un approccio di genetica inversa. Per dimostrare una possibile combinazione di approcci, descriviamo qui una schermata di interazione RNAi mirata, a partire con un mutante di guadagno di funzione cistica canale escretore, etichettati con la proteina fluorescente citoplasmico canale verde (GFP). Il fenotipo mutante è stato generato da una sovraespressione di erm-1, un altamente conservata di c. elegans ortholog della famiglia del linker membrana-actina ezrina-radixina-moesina (ERM), che è stato implicato nella morfogenesi del lume e della membrana organizzazione in molte specie¹². C. elegans ERM-1 si localizza lumenal membrane degli organi interni, come ad esempio il canale escretore e intestino ed è necessario per la formazione di lumen in sia¹³. Sovraespressione di ERM-1 recluta actina in eccesso e vescicole alla membrana lumenal del canale, aumentando il flusso nel lumen e generando un breve canale cistico e una membrana di lumenal aggraffata con actina ispessita sottopelo⁹. Il protocollo descrive come generare ceppi transgenici con escretivo-canal-espresso etichettato proteine di fusione (o altre proteine); come eseguire mirati schermi RNAi a partire con tali ceppi, per identificare i modificatori di un fenotipo di canale; e come analizzare visivamente i risultati di tali schermi di dissezione e confocale microscopia a fluorescenza tra cui semplici modi per quantificare tubulogenesis informativo fenotipi. Alternativa i dettagli del RNAi, regolato per i geni di tubulogenesis spesso letale e tecniche di etichettatura si trovano nel libro d’accompagnamento sulla tubulogenesis intestinale³. Tutti i metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per l’indagine sulle altre domande sul canale tubulogenesis.