Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

האסטרוציטים להשפיע על תפקוד המוח באמצעות תמיכה עם מחלות, זרימת הדם, איתות סינפטית, פלסטיות ותקשורת המערכת – כל אלה הם מנגנונים מרכז סביב התהליכים astrocytic דק. פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן מאפשר חקר תהליכים אלו ללא הפרעה בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד, אשר הוא שימושי למשל, כי הביטוי של חלבונים רבים ו- Ca^{2 +} איתות אפילו חופפים מעבר לתא מוח סוגי. עוד יותר, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות זמינים בעבר. בפרט, פרוטוקול שלנו מספק ויוו-כמו מורפולוגיה (stellate האסטרוציטים עם תהליכים דק), ביטוי גנים, מהיר, קל, ואופן זול.

מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים רבים תהליכים רגולטוריים אחרים מושפעים ישירות הסביבה. בקערה תרבות, זה מתייחס לגורמים שפורסמו על ידי התאים שמסביב, אלא גם המדיום שבו התאים גדלים. עבור האסטרוציטים, HBEGF דווחה בעבר לזירוז stellate מורפולוגיה¹ אבל נמצאה גם מבטל את להבדיל האסטרוציטים². עם זאת, ריכוז נמוך יותר של HBEGF שימשו מאוחר יותר ליצירת עוד ויוו-כמו האסטרוציטים כפי שזוהו באמצעות רצפי RNA שני פרוטוקולים שונים^3,4. יתר על כן, מורפולוגיה אסטרוציט משתנה להרכב בינוני, ללא קשר פרוטוקול⁴: Neurobasal בינוני עם ריכוז נמוך של HBEGF הוא אופטימלי לגידול האסטרוציטים stellate, בעוד אחרים יצירות בינונית (למשל, סרום-המכיל DMEM) מייצר תאים מצולע (אפילו ב האסטרוציטים טרי מבודדת על ידי immunopanning).

פרוטוקול AWESAM גוברת על החסרונות של טכניקות הקודם לגידול אסטרוציט monocultures⁴. שיטות קודמות לגידול אסטרוציט monocultures יש חסרונות הבאים: מורפולוגיה מצולע, וזה דיי האסטרוציטים stellate ויוו (שיטת MD)⁵; האורך ואת העלות של פרוטוקול (הכנת האסטרוציטים מ pluripotent המושרה בתאי גזע לוקח שלושה חודשים ודורש נוגדנים רבים, לרבות גורמי גדילה יקר)⁶; כמויות נמוכות של חומר (שיטת immunopanning)³; את הבידול והתבקשתי של האסטרוציטים, הדרישה של מטריצה תלת-ממד (Puschmann et al.) ^{1 , 2}. לעומת זאת, פרוטוקול AWESAM מספק: ויוו-כמו מורפולוגיה (האסטרוציטים stellate עם תהליכים דק); מהר, לאט, ושיטת זולים; כמויות גדולות של חומר; הכי אין ויוו-כמו ביטוי גנים לעומת immunopanned ו MD האסטרוציטים. בנוסף, תרבות דו-מימדית מאפשרת לצורך המחקר של איתות^{2 +} Ca, מיחזור תהליכים דק, וכן אירועים קרוב הקרום שלפוחית (למשלמיקרוסקופ TIRF בלתי אפשרי בתרבויות תלת-ממד).

השיטה MD שימש בהרחבה מאז פרסומו ב- 1980⁵, מציעה טכניקה פשוטה ומהירה עבור monocultures אסטרוציט מצולע. בקיצור, השיטה MD כרוך תאי המוח מעורבות גוברת בנסיוב עגל עוברית (FCS)-המכיל DMEM, ואחריו רועד צעדים להעשיר עבור האסטרוציטים (כמו כל שאר סוגי לנתק מתוך קערה לתא מוח), תרבות נוספת במדיום אותו. DMEM בתוספת FCS משמש עבור שאר סוגי תאים רבים, החל fibroblasts adipocytes שורות תאים סרטן שונים, צמודות המבנה מצולעים הוצגו על ידי MD האסטרוציטים בתרבות. עד בתחילת שנות האלפיים⁷, היה קצת מחשבה בהתחשב מדיה המותאמים האסטרוציטים, במיוחד את האמונים שלהם מורפולוגיה stellate טיפוסי נמצאו vivo בתוך. פרוטוקול אחד שפורסם בשנת 2011 להשיג כזה מורפולוגיה stellate: קראו את שיטת immunopanning, היא מעסיקה בינונית ללא סרום אופטימיזציה עבור culturing האסטרוציטים³. באמצעות שיטה זו, תאי מוח טרי מבודד חשופים סדרה של מנות מצופה נוגדנים יעד ייחודיים לסוג התא חלבונים פני שטח התא, להעשיר עבור האסטרוציטים. למרות ה יותר ויוו-כמו פרופיל ביטוי ומורפולוגיה של immunopanned האסטרוציטים, הרוב המכריע של מחקרים במבחנה עדיין מסתמכים על השיטה אסטרוציט MD. השיטה MD היא פשוטה ומהירה, בעוד השיטה immunopanning כוללת יותר מורכב ולגזול צעדים ביום הראשון של תרבות (כגון אנזים עיכול תקופות ארוכות יותר, זהיר שכבות של פתרונות של צפיפות שונה, immunopanning עצמה, ו מספר צנטריפוגה שלבים – הכל לפני ציפוי). עם זאת, באמצעות מדיום יותר מיוחדים, שיטת AWESAM מציע שני את המהירות של השיטה MD ו ה ויוו-כמו מורפולוגיה של הפרוטוקול immunopanning.

בסך הכל, פרוטוקול AWESAM שימושית ללמוד יותר ויוו-כמו האסטרוציטים ב- 2D monocultures מבודדת בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד (כפי שנעשה בעבר⁴ על ידי immunostainings, immunoblots, רצפי RNA). זה מאפשר לחקר תהליכים astrocytic דק, וכן מספקת נגישות מעולה להמחשת ספונטנית של Ca^{2 +} איתות ואירועים בקרבת הקרום (למשל, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF).