استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

أستروسيتيس تؤثر على وظيفة المخ من خلال الدعم الغذائي وتدفق الدم، وإشارات متشابك واللدونه والاتصالات بين الخلايا–وهي الآليات التي تتمحور حول عمليات أستروسيتيك رقيقة. يسمح البروتوكول أوسام الموصوفة هنا دراسة هذه العمليات دون تدخل من الخلايا العصبية وغيرها إطلاق، ومفيدة مثلاً، للتعبير عن العديد من البروتينات وحتى Ca^{2 +} إشارات التداخل عبر خلايا الدماغ المختلفة أنواع. علاوة على ذلك، هذا الأسلوب يتغلب على القيود المفروضة على التقنيات المتاحة سابقا. على وجه الخصوص، يوفر لنا البروتوكول في فيفو–مثل طريقة رخيصة والتعبير الجيني في سريعة، سهلة، ومورفولوجيا (النجمية astrocytes مع العمليات رقيقة).

مورفولوجيا الخلايا والجينات، والعديد من العمليات التنظيمية الأخرى تتأثر مباشرة بالبيئة. في صحن ثقافة، يشير هذا إلى عوامل الصادرة عن الخلايا المحيطة بها، ولكن أيضا الوسيلة التي تزرع الخلايا. أستروسيتيس، هبيجف أفيد سابقا للحث على مورفولوجيا النجمية¹ لكن وجد أيضا إزالة التمييز بين أستروسيتيس². ومع ذلك، استخدمت تركيزات أقل من هبيجف في وقت لاحق لتوليد المزيد في فيفو–مثل أستروسيتيس كما حددت عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي في اثنين من البروتوكولات المختلفة^3،4. وعلاوة على ذلك، تتغير مورفولوجيا astrocyte مع تكوين المتوسطة، بغض النظر عن البروتوكول⁴: المتوسطة نيوروباسال بتركيز منخفض من هبيجف الأمثل لزراعة النجمية astrocytes، بينما الأخرى التراكيب متوسطة الحجم (مثلاً، مصل الدم المحتوية على دميم) إنتاج خلايا مضلعة (حتى في أستروسيتيس طازجة تم عزلة بواسطة إيمونوبانينج).

بروتوكول أوسام ويتغلب على عيوب الأساليب السابقة لزراعة الزراعات الأحادية أستروسيتي⁴. التقنيات السابقة لزراعة الزراعات الأحادية astrocyte قد العيوب التالية: مورفولوجيا المضلع، وغير معهود من النجمية astrocytes في فيفو (الأسلوب MD)⁵؛ طول وتكلفة من البروتوكول (إعداد أستروسيتيس من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent يأخذ ثلاثة أشهر ويتطلب العديد من الكواشف، بما في ذلك تكلفة عوامل النمو)⁶؛ كميات قليلة من المواد (طريقة إيمونوبانينج)³؛ والتفريق بين دي astrocytes واشتراط مصفوفة ثلاثية الأبعاد (بوشمان et al.) ^{1 , 2}. وفي المقابل، يوفر البروتوكول أوسام: في فيفو–مثل مورفولوجيا (النجمية astrocytes مع العمليات رقيقة)؛ سريعة وسهلة، وطريقة رخيصة؛ كميات كبيرة من المواد؛ والأكثر في فيفو–مثل التعبير الجيني بالمقارنة مع إيمونوبانيد والعضو المنتدب أستروسيتيس. بالإضافة إلى ذلك، يسمح الثقافة 2D لدراسة Ca^{2 +} الإشارات وإعادة التدوير في عمليات رقيقة، وفي أحداث قريبة من الغشاء حويصلة (مثلاً، TIRF المجهري ليست ممكنة في الثقافات 3D).

وقد استخدمت الأسلوب MD على نطاق واسع منذ صدوره في عام 1980⁵، تقدم تقنية بسيطة وسريعة للزراعات الأحادية astrocyte المضلع. وباختصار، ينطوي الأسلوب MD تنامي خلايا المخ المختلطة في مصل العجل الجنين (FCS)-تحتوي على دميم، تليها تهز الخطوات التي يغني عن astrocytes (كسائر أنواع فصل من الطبق خلايا الدماغ) وكذلك الثقافة في المتوسط نفسها. ويستخدم دميم وتستكمل مع السفح للعديد من أنواع الخلايا الأخرى، بدءاً من الخلايا الليفية و adipocytes خطوط الخلايا السرطان المختلفة، كل منها حصة مورفولوجية المضلع أظهرتها astrocytes العضو المنتدب في الثقافة. حتى أوائل القرن الحادي والعشرين⁷، يكن الفكر قليلاً نظراً لوسائل الإعلام لتلائم astrocytes، على وجه التحديد لصالح على مورفولوجيا النجمية نموذجي وجدت فيفو في. بروتوكول واحد ونشرت في عام 2011 تحقيق مثل هذا التشكل النجمية: استدعاء الأسلوب إيمونوبانينج، أنها توظف المتوسطة خالية من المصل الأمثل لاستزراع astrocytes³. باستخدام هذا الأسلوب، تتعرض خلايا المخ طازجة معزولة لسلسلة من الأطباق المغلفة بالأجسام المضادة التي تستهدف الخلية الخلية المحددة بنوع البروتينات السطحية، إثراء ل astrocytes. على الرغم من أكثر في فيفو–مثل مورفولوجيا والتعبير الشخصية من أستروسيتيس إيمونوبانيد، لا تزال تعتمد على الأسلوب astrocyte MD معظم الدراسات في المختبر . الأسلوب MD بسيط وسريع، بينما الأسلوب إيمونوبانينج تضم أكثر من خطوات معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً اليوم الأول للثقافة (مثل فترات أطول إنزيم الهضم، طبقات حذراً من حلول كثافة مختلفة، إيمونوبانينج نفسها، و عدة الطرد المركزي الخطوات-كل شيء قبل الطلاء). ومع ذلك، باستخدام المتوسط أكثر تخصصا، يقدم الأسلوب أوسام كلا سرعة الأسلوب MD و في فيفو–مثل مورفولوجيا بروتوكول إيمونوبانينج.

عموما، بروتوكول أوسام مفيدة لدراسة أكثر في فيفو–مثل أستروسيتيس في 2D الزراعات الأحادية المعزولة من الخلايا العصبية وإطلاق أخرى (ك تتسم سابقا⁴ إيمونوستينينجس، إيمونوبلوتس، وتسلسل الحمض النووي الريبي). أنها تسمح لدراسة العمليات أستروسيتيك رقيقة، ويوفر إمكانية كبيرة لتصور Ca^{2 +} إشارات عفوية وأحداث قريبة من الغشاء (مثلاً، تصويرها بالمجهر TIRF).