Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

Astrocyten beïnvloeden hersenfunctie door trofische ondersteuning, doorbloeding, synaptic signaling en plasticiteit en intercellulaire communicatie – die allemaal mechanismen die centrum rond de dunne astrocytic processen. Het protocol van de AWESAM die hier worden beschreven kunt de studie van deze processen zonder inmenging van neuronen en andere glia, die nuttige bv, omdat de expressie van veel eiwitten en zelfs Ca^{2 +} signalering overlappen in verschillende hersenen cel typen. Verder is deze methode overwint beperkingen van de voorheen beschikbare technieken. In het bijzonder onze protocol voorziet in vivo-zoals morfologie (Notti astrocyten met dunne processen) en genexpressie in een snelle, gemakkelijk, en goedkope wijze.

Cel morfologie, genuitdrukking en vele andere regelgevende processen worden rechtstreeks beïnvloed door het milieu. In een cultuur schotel verwijst dit naar de factoren die zijn vrijgegeven door de omringende cellen, maar ook het medium waarin de cellen worden gekweekt. Voor astrocyten, HBEGF voorheen werd gerapporteerd voor het opwekken van een Notti morfologie¹ maar ook om te-onderscheiden astrocyten²werd gevonden. Echter lagere concentraties van HBEGF werden later gebruikt voor het genereren van meer in-vivo-evenals de astrocyten geïdentificeerd met behulp van RNA sequencing in twee verschillende protocollen^3,4. Bovendien Astrocyt morfologie verandert met de middellange samenstelling, ongeacht het protocol⁴: Neurobasal medium met een lage concentratie van HBEGF is optimaal voor het kweken van Notti astrocyten, terwijl andere middellange composities (b.v. serum-bevattende DMEM) produceren veelhoekige cellen (zelfs in astrocyten vers geïsoleerd door immunopanning).

Het AWESAM-protocol overwint nadelen van vorige technieken voor het kweken van Astrocyt monoculturen⁴. Vorige technieken voor het kweken van Astrocyt monoculturen hebben de volgende nadelen: veelhoekige morfologie, die ongebruikelijk van Notti astrocyten in vivo (methode MD)⁵; de lengte en kosten van protocol (voorbereiding van astrocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen duurt drie maanden en vereist veel reagentia, met inbegrip van dure groeifactoren)⁶; de lage hoeveelheid materiaal (methode immunopanning)³; de ambtshalve differentiatie van astrocyten en eis van een 3D matrix (Puschmann et al.) ^{1 , 2}. daarentegen het AWESAM-protocol biedt: in vivo-graag morfologie (Notti astrocyten met dunne processen); een snel, eenvoudig, en goedkope methode; grote hoeveelheden materiaal; en het meest in vivo-graag genexpressie vergeleken met immunopanned en MD astrocyten. Bovendien, 2D cultuur zorgt voor de studie van Ca^{2 +} signalering en vesikel recycling in dunne processen, en in gebeurtenissen dichtbij het membraan (b.v.TIRF microscopie is niet mogelijk in 3D culturen).

De MD-methode werd uitvoerig gebruikt sinds haarbekendmaking in 1980⁵, biedt een eenvoudige en snelle techniek voor veelhoekige Astrocyt monoculturen. Kortom, de MD-methode met zich meebrengt groeiende gemengde hersencellen in foetaal kalfsserum (FCS)-bevattende DMEM, gevolgd door schudden van de stappen die verrijken voor astrocyten (als alle andere hersenen cel typen van de schotel loskoppelen) en verder cultuur in hetzelfde medium. DMEM aangevuld met FCS wordt gebruikt voor veel andere celtypen, variërend van fibroblasten en adipocytes tot verschillende kanker cellijnen, die allemaal de veelhoekige morfologie tentoongesteld door MD astrocyten bij cultuur delen. Tot de vroege 2000s⁷, weinig gedachte hadden gegeven aan media op maat van astrocyten, specifiek om de gunst van hun typische Notti morfologie gevonden in vivo. Één protocol gepubliceerd in 2011 het bereiken van dergelijke Notti morfologie: de immunopanning-methode aangeroepen, er werken serumvrij medium geoptimaliseerd voor het kweken van astrocyten³. Met behulp van deze methode, worden vers geïsoleerde hersencellen blootgesteld aan een aantal gerechten bekleed met antilichamen die gericht zijn op cel type-specifieke cel-oppervlakte eiwitten, te verrijken voor de astrocyten. Ondanks de meer in-vivo-net als morfologie en expressie profiel van immunopanned astrocyten, de meerderheid van in vitro studies nog steeds beroepen op de MD Astrocyt methode. De MD-methode is eenvoudig en snel, terwijl de immunopanning methode meer complexe en tijdrovende stappen op de eerste dag van cultuur omvat (zoals spijsvertering voor langere enzym, zorgvuldige gelaagdheid van oplossingen van verschillende dichtheid, immunopanning zelf, en verschillende centrifugeren stappen – allemaal voordat plating). Met behulp van meer gespecialiseerde medium, de AWESAM-methode biedt echter zowel de snelheid van de MD-methode en de in-vivo-graag morfologie van het immunopanning-protocol.

Globaal, het AWESAM-protocol is handig voor studeren meer in-vivo-graag astrocyten in 2D monoculturen geïsoleerd van neuronen en andere glia (als eerder gekarakteriseerd⁴ door immunostainings en immunoblots RNA sequencing). Het voorziet in de studie van dunne astrocytic processen, en biedt grote toegankelijkheid voor het visualiseren van spontane Ca^{2 +} signalering en evenementen dichtbij het membraan (bvbeeld door TIRF microscopie).