Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

Los astrocitos influyen en función cerebral a través de soporte trófico, flujo sanguíneo, señalización sináptica y plasticidad y comunicación intercelular – todos los cuales son mecanismos que se centran en los procesos astrocytic finos. El protocolo AWESAM se describe aquí permite el estudio de estos procesos sin la interferencia de las neuronas y otros glía, que es útil por ejemplo, porque la expresión de muchas proteínas y Ca^{2 +} señalización incluso se superponen en células cerebrales diferentes tipos. Además, este método supera limitaciones de las técnicas previamente disponibles. En particular, nuestro protocolo proporciona en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos) y expresión génica en un quick, easy y manera barata.

Morfología celular, expresión génica y muchos otros procesos normativos están directamente influenciadas por el medio ambiente. En una placa de cultivo, esto se refiere a factores liberados por las células circundantes, sino también el medio en que crecen las células. Por astrocitos, HBEGF fue divulgado previamente para inducir una morfología radiada¹ pero también fue encontrado para diferenciar de astrocitos². Sin embargo, concentraciones más bajas de HBEGF fueron utilizadas más adelante para generar más en vivo-como astrocitos identificados a través de la secuencia de RNA en dos protocolos diferentes de^3,4. Por otra parte, cambios de morfología de astrositos con la composición del medio, sin importar el protocolo⁴: Neurobasal medio con una concentración baja de HBEGF es óptimo para el cultivo de astrocitos estrellados, mientras que otras composiciones medianas (p. ej., suero que contienen DMEM) producen las células poligonales (incluso en los astrocitos recién aislados por immunopanning).

El protocolo AWESAM supera los inconvenientes de las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos⁴. Las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos tienen las siguientes desventajas: morfología poligonal, que es poco característica de astrocitos estrellados en vivo (método de MD)⁵; la longitud y el costo del Protocolo (preparación de astrocitos de células madre pluripotentes inducidas se lleva tres meses y requiere de muchos reactivos, incluyendo costosos factores de crecimiento)⁶; las bajas cantidades de material (método immunopanning)³; y la la diferenciación de astrocitos y el requisito de una matriz 3D (Puschmann et al.) ^{1 , 2}. en contraste, el protocolo AWESAM proporciona: en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos); una rápida, fácil y barato método; grandes cantidades de material; y más en vivo-como la expresión del gen en comparación con immunopanned y astrocitos MD. Además, cultura 2D permite el estudio de Ca^{2 +} señalización y reciclaje en los procesos de finos y en eventos cerca de la membrana de la vesícula (por ejemplo, microscopía TIRF no es posible en las culturas 3D).

El método de MD se ha utilizado extensivamente desde su publicación en 1980⁵, ofreciendo una técnica simple y rápida para monocultivos de astrositos poligonal. En Resumen, el método MD exige creciente neuronas mezclado en el suero fetal de ternero (FCS)-que contienen DMEM, siguió agitando pasos que enriquecen de astrocitos (como todas las otras células cerebrales tipos separan del plato) y más de la cultura en el mismo medio. DMEM suplementado con FCS se utiliza para muchos otros tipos de células, que van desde fibroblastos y adipocitos a líneas celulares de cáncer diferentes, todos los cuales comparten la morfología poligonal exhibida por astrocitos MD en la cultura. Hasta el temprano 2000s⁷, poco pensamiento había sido dado a los medios de comunicación a la medida de los astrocitos, específicamente a favor de su típica morfología radiada encontrado en vivo. Un protocolo publicado en 2011 alcanzar tal morfología radiada: llama al método immunopanning, emplea medio libre de suero optimizado para el cultivo de astrocitos³. Usando este método, las células cerebrales recién aislados están expuestas a una serie de platos recubiertos con anticuerpos que atacan células específicas del tipo celular proteínas de la superficie, para enriquecer por astrocitos. A pesar de más en vivo-como perfil morfología y expresión de immunopanned astrocitos, la mayoría de los estudios en vitro todavía dependen del método de astrositos MD. El método de la MD es sencillo y rápido, mientras que el método immunopanning compone de pasos más complejo y desperdiciador de tiempo en el primer día de la cultura (como períodos de digestión enzimática, y cuidado de soluciones de diferentes densidades, immunopanning, y varios centrifugación pasos – todo antes de placas). Sin embargo, utilizando el medio más especializado, el método AWESAM ofrece tanto la velocidad del método de la MD y la en vivo-como morfología del protocolo immunopanning.

En general, el protocolo AWESAM es útil para estudiar más en vivo-como astrocytes en 2D monocultivos aislados de neuronas y glia de otros (como previamente caracterizados⁴ immunostainings, immunoblots y secuenciación del RNA). Permite el estudio de los procesos astrocytic finos y proporciona gran accesibilidad para la visualización de eventos cerca de la membrana (e.g., reflejada por microscopía TIRF) y Ca^{2 +} señalización espontánea.