בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי
Summary
המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.
Abstract
קיומו של אנדותל ובתאים (EPCs) בדם היקפי ומעורבותו vasculogenesis דווחה לראשונה על ידי Ashara ועמיתיו1. מאוחר יותר, אחרים תיעד את קיום סוגים דומים של EPCs שמקורם במח העצם2,3. לאחרונה, Yoder אינגרם הראה כי EPCs נגזר דם חבל הטבור היה גבוה יותר proliferative פוטנציאל לעומת אלה מבודד למבוגרים היקפיים דם4,5,6. מלבד היותו מעורב vasculogenesis כמחנכת, EPCs גם הראו הבטחה כמקור תא ליצירת רקמות מהונדסים כלי הדם והלב שסתום בונה7,8. קיימות תקנות בידוד שונות, חלקן כרוכות המיון התא של תאי תאים (MNCs) נגזר מן המקורות שהזכרנו קודם בעזרת סמנים אנדותל, hematopoietic, או culturing אלה MNCs עם צמיחה אנדותל מיוחדים בינוני, או שילוב של טכניקות אלה9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד, תרבות של EPCs באמצעות והתמחה אנדותל בינוני עם גורמי גדילה, ללא שימוש immunosorting, ואחריו את האפיון של תאים מבודדים באמצעות סופג המערבי, immunostaining.
Introduction
מספר חוקרים חקרו את המאפיינים ואת הפוטנציאל של האדם EPCs5,10,11,12,13. EPCs יכול להיות מתואר מחזורי תאים בעלי היכולת לדבוק רקמת אנדותל באתרים של היפוקסיה, איסכמיה, פציעה או היווצרות הגידול ולתרום היווצרות של כלי דם מבנים חדשים4,14. מעורבותם שנצפה כורוידאלית, בצורה של vasculogenesis כמחנכת, הובילה להבנה של הפתופיזיולוגיה של תאים אלה והשימוש שלהם יישומים טיפוליים4,15, 16. מספר EPCs של הפרט הוכח להיות בקורלציה עם מחלה קרדיו9,15,16,17,18,19 ,20. מחקרים אחרים יש גם הבדיל EPCs לתוך הפנוטיפ פיברובלסט כמו שסתום, הציע כי תאים אלה יכול לשמש עבור הנדסת רקמות הלב שסתומים7,21.
המסוים המולקולות על פני התא צריך לבודד EPCs לא זוהו בבירור עקב אי-התאמות בין חקירות4. הדבקה של MNCs על מטריצה מסוימים, עם חשיפה למגוון רחב של תנאים תרבות, בוצעה על ידי מספר קבוצות1,17,22,23, רומז כי ייתכן EPCs בשם הצגת מאפיינים פנוטיפי שונים. מאפיינים אלה כוללים חוסר יכולת phagocytotic, שפופרת-צורה Matrigel ואת ספיגת של ליפופרוטאין בצפיפות acetylated-דיל. Clonogenic גבוהה ופוטנציאל proliferative הם שני מאפיינים עם EPCs אשר ניתן hierarchized5. EPCs יכול גם טופס במבחנה בקוריאנית כאשר cocultured עם ריאות העובר האנושי fibroblasts4. תאים אלה ידועים לבטא סמני פני השטח של תאי אנדותל וכדי לחלוק חלק סמנים hematopoietic13,24,25. הסמנים ביטוי חיובי זה מקובל עבור phenotyping EPCs הם CD31, CD34, צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 2 (VEGFR2), Willebrand פון פקטור (vWF), CD133, c-Kit, ואת כלי הדם קדהרין אנדותל (VE-קדהרין)4 , 18. תאים המבטאים שיתוף CD90, CD45, CD14, CD115 או אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA) לא נחשבים EPCs בגלל מוגבל proliferative פוטנציאל, היכולת שלהם phagocytose חיידקים, וחוסר יכולת ליצור דה נובו אנושי כלי ויוו4,7. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה עבור בידודו של אנדותל ובתאים של דם טבורי האנושית ללא צורך תא כלשהו מיון פרוטוקולים. במאמר זה, השתמשנו CD31, CD34 ו VEGFR2 כסמני חיובית, עם α-SMA כאינדיקטור שלילי.
במאמר זה, אנו מציעים שיטה של בידוד ושל culturing ובתאים אנדותל של דם טבורי ללא תא מיון באמצעות התמחה מדיום הגידול אנדותל עם גורמי גדילה (EGM). EGM זו מכילה כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) ואשר גורם הצמיחה פיברובלסט (FGF), לשפר את ההישרדות, התפשטות והעברה של תאי אנדותל26. זה כולל גם חומצה אסקורבית, האחראית על שמירה על המורפולוגיה המרוצף של תאים; דמויי אינסולין גורם גדילה-1 (IGF-1), אשר מספק האנגיוגנזה ותפקוד הנדידה; הפארין, אשר גורמת לשיפור יציבות לטווח ארוך של גורמי גדילה בינונית26. גורמי גדילה אחרים שיתווספו המדיום התרבות תאי אנדותל כולל תוספי עם גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר מסייע התפשטות תאים מגרה בידול, ואת הידרוקורטיזון, אשר sensitizes לתאים EGF26 . אנו מראים כי השימוש של מדיום הגידול הספציפי הזה מניב מספר גבוה יותר של EPCs לעומת אנדותל הבזליים בינוני (EBM) או של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM).
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שהוזכר קודם, מחסידי EPCs בעלי מורפולוגיה המרוצף. MNCs מבודד שלנו התקדם מ מושבה תא בצורת כישור (איור 2א-2D) בשלבים המוקדמים למושבת קאבלסטון (איור 2E-2F) על פני תקופה של 10 ימים בתרבות. EPCs סומנו כאנטי באופן שונה על ידי קבוצות מחקר שונות, כלומר כמו ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס CMMI-1452943 ועל ידי המכללה בהצטיינות אוניברסיטת ארקנסו. אנחנו גם רוצים להכיר את בנק דם טבורי ארקנסו סיפק לנו כבל יחידות דם.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
