ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離
Summary
このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ マーカーとしてこれらの細胞を使用して、作成組織設計の血管や心臓の弁を構築あります。
Abstract
末梢血血管内皮前駆細胞 (Epc) の存在とその血管関与 Ashara と同僚1によって報告されました。後で、他の人は骨髄2,3から発信された Epc の類似の種類の存在を記載されています。最近では、ヨーダとイングラム臍帯血由来の Epc を示した可能性があった、高い増殖大人周辺から分離されたものと比較して血の4,5,6。生後の発生に関与しているから離れて Epc また組織設計血管や心臓弁構造7、8を作成するための細胞源として約束を示しています。様々 な隔離のプロトコルが存在、内皮細胞および造血のマーカーの助けを借りて、上記のソースから派生した単核細胞 (多国籍企業) のセルの並べ替えや養殖専門内皮増殖とこれらの多国籍企業を含むいくつか媒体、またはこれらの技術9の組み合わせ。ここでは、隔離のためのプロトコルを提案する、Epc を使用しての文化専門血管内皮成長因子、西部にしみが付くことを使用して隔離されたセルの特性評価に続いて immunosorting を使用せず培と免疫染色。
Introduction
いくつかの調査官は、特性と人間 Epc5,10、11,12,13の可能性を勉強しています。Epc は、循環血管内皮組織低酸素、虚血、外傷、あるいは腫瘍形成のサイトに従うし、新しい血管構造4,14の形成に貢献する能力を持っている細胞として記述することができます。観測へ生後発生の形での血管新生の関与は、これらの細胞とその治療への応用4,15,の病態生理の理解につながっている16. 心血管の病理学9,15,16,17,と18,19 相関する個々 の Epc の数が示されています。 ,20。他の研究も Epc を弁線維芽細胞のような表現型に分化して組織工学心臓弁7、21のこれらの細胞を使用できることを提案しました。
調査4間の不一致のための Epc を分離するために必要な特定の細胞表面分子が明確に識別されていません。いくつかグループ1,17,22,23, Epc の推定される可能性があることを示唆によって実行された多国籍企業のさまざまな培養条件への露出で、特定のマトリックスへの接着異なる表現型プロパティを表示します。これらのプロパティには、貪食能力、マトリゲル、管形成と Dil アセチル化低密度リポタンパク質の摂取量の不足が含まれます。高いクローンと増殖能は、どの Epc と階層化された5をすることができます 2 つのプロパティです。Epc はまた4ひと胎児肺線維芽細胞の遊走と、体外に尿細管を形成できます。これらの細胞は、血管内皮細胞表面マーカーを表現して造血マーカー13,24,25のいくつかを共有するために知られています。フェノタイピング Epc の広く受け入れられている積極的に表現されたマーカーは CD31 CD34、血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2)、フォン ・ ヴィレブランド因子 (vWF)、CD133、c キットと血管内皮細胞のカドヘリン (VE カドヘリン)4,18. 共同 CD90、CD45、CD14、CD115、または α-平滑筋アクチン (α SMA) を発現する細胞が貪食、細菌およびde novo人間を形成することができない限られた増殖、潜在的な能力のため Epc をするとは見なされません船生体内で4,7。この資料では、プロトコルをソートの任意のセルを必要とせず人間の臍帯血から血管内皮前駆細胞の分離のための修正されたプロトコルについて説明します。この記事の負のインジケーターとして α SMA との肯定的なマーカーとして VEGFR2、CD34、CD31 を使いました。
この記事での分離及び細胞を使用して選別することがなく臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を培養法特化成長因子 (EGM) と内皮増殖培を提案する.この EGM には、血管内皮増殖因子 (VEGF) と線維芽細胞成長因子 (FGF)、生存、増殖、および内皮細胞26の移行を強化が含まれています。セルの石畳の形態を維持するために責任があるアスコルビン酸も含まれていますインスリン様成長因子-1 (IGF-1 の)、血管新生と渡り鳥関数を提供します。成長因子の長期的な安定性の向上は、中型26ヘパリン。血管内皮細胞の培養液に追加他の成長因子には EGF26 に細胞の感受性を高める、ヒドロコルチゾンと分化、細胞増殖を刺激するのに役立ちます表皮の成長因子 (EGF) の補充が含まれています.この特定の成長媒体の使用の Epc 内皮細胞基本培地 (EBM) またはダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と比較して高い数値を生成することを示す.
Protocol
Representative Results
Discussion
前述したように、付着性の Epc は、石畳の形態を所有しています。私たちの孤立した多国籍企業から進歩した紡錘形細胞コロニー (図 2A 2 D) 初期段階で石畳の植民地 (図 2E 2 階) に 10 日間の培養期間。Epc ラベル付けされている異なる研究グループによって異なる後期の血管内皮前駆細胞の10、としてすなわ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この材料はグラント号下の国立科学財団によってサポートされる作業に基づいてください。CMMI 1452943、アーカンソー大学の名誉の大学によって。我々 はまたアーカンソーの臍帯血バンク臍帯血の単位を提供する私たちを認識したいと思います。
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
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