Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain
Summary
Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.
Abstract
L’existence de cellules endothéliales progénitrices (EPCs) dans le sang périphérique et son implication dans la vasculogénèse a été signalée par Ashara et ses collègues1. Plus tard, d’autres documenté l’existence de types similaires de EPCs provenant de la moelle osseuse2,3. Plus récemment, Yoder et Ingram a révélé que EPCs provenant du sang de cordon ombilical avaient un potentiel prolifératif plus élevé par rapport à ceux isolés d’adulte périphérique de sang4,5,6. En dehors de n’être impliqué en postnatal vasculogénèse, EPCs ont également montré des promesse comme une source de cellules pour créer tissulaire cardiaque et vasculaire vanne constructions7,8. Il existe différents protocoles d’isolement, dont certaines impliquent le tri cellulaire des cellules mononucléaires (PTM) dérivés les sources mentionnées plus tôt avec l’aide de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, ou cultivant ces multinationales avec la croissance endothéliale spécialisée moyenne, ou une combinaison de ces techniques9. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et culture des CPE à l’aide spécialisée endothélial additionné de facteurs de croissance, sans utiliser d’immunosorting, suivie de la caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blot et immunomarquage.
Introduction
Plusieurs chercheurs ont étudié les caractéristiques et le potentiel humain EPCs5,10,11,12,13. CPE peut être qualifiée de circuler les cellules qui ont la capacité d’adhérer aux tissus endothéliales dans les sites d’hypoxie, ischémie, des blessures ou la formation de tumeurs et contribuent à la formation de nouvelles structures vasculaires4,14. Leur implication observée dans la néovascularisation, sous forme de vasculogénèse postnatal, a conduit à la compréhension de la physiopathologie de ces cellules et leur utilisation dans des applications thérapeutiques4,15, 16. le nombre de CPE chez un individu s’est avéré être en corrélation avec la pathologie cardiovasculaire9,15,16,17,18,19 ,,20. D’autres études ont également différenciées EPCs dans un phénotype de fibroblastes-comme soupape et proposé que ces cellules pourraient être utilisées pour l’ingénierie tissulaire cardiaque vannes7,21.
Les molécules de surface de cellule particulière nécessaires pour isoler les EPCs n’ont pas été clairement identifiés en raison de divergences entre les enquêtes4. L’adhérence des multinationales à une certaine matrice, avec une exposition à une variété de conditions de culture, a été interprétée par plusieurs groupes1,17,22,23, suggérant que putatifs EPCs peuvent afficher les différentes propriétés phénotypiques. Ces propriétés incluent un manque de capacité de phagocytose, la formation du tube en Matrigel et la captation des lipoprotéines de basse densité Dil-acétylé. La haute clonogéniques et potentiel prolifératif sont deux propriétés avec laquelle EPCs peuvent être hiérarchisés5. CPE peut également former des tubules in vitro lorsque co-cultivées avec des poumons foetaux humains fibroblastes4. Ces cellules sont connues pour exprimer des marqueurs de surface des cellules endothéliales et de partager certaines des marqueurs hématopoïétiques13,24,25. Les marqueurs positivement exprimées largement acceptées pour le phénotypage EPCs sont CD31, CD34, récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de facteur, CD133, c-Kit et vasculaires endothéliales cadhérine (VE-cadhérine)4 , 18. cellules qui expriment conjointement CD90, CD45, CD14, CD115 ou actine muscle lisse-alpha (α-SMA) ne sont pas considérés comme être EPCs en raison de leur capacité potentielle, proliférative limitée à phagocyter les bactéries et incapacité de former de novo humaine navires en vivo4,7. Cet article décrit un protocole modifié pour l’isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain sans besoin de n’importe quelle cellule protocoles de tri. Pour cet article, nous avons utilisé le CD31, CD34 et VEGFR2 comme les marqueurs positifs, avec α-SMA comme indicateur négatif.
Dans cet article, nous proposons une méthode d’isoler et de cultiver des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical sans cellule tri à l’aide spécialisée de milieu de croissance endothéliale additionné de facteurs de croissance (EGM). Cette EGM contient le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance fibroblastique (FGF), qui améliorent la survie, la prolifération et la migration des cellules endothéliales26. Il comprend également l’acide ascorbique, qui est responsable du maintien de la morphologie de pavées des cellules ; insuline-comme le facteur de croissance-1 (IGF-1), qui fournit angiogénique et fonction migrateur ; et l’héparine, ce qui provoque la meilleure stabilité à long terme des facteurs de croissance en moyenne26. Autres facteurs de croissance, ajoutés le milieu de culture de cellules endothéliales comprend une supplémentation en facteur de croissance épidermique (EGF), qui aide à stimuler la prolifération cellulaire et la différenciation et hydrocortisone, qui sensibilise les cellules à EGF26 . Nous montrons que l’utilisation de ce support de croissance spécifique conduit à un nombre plus élevé de l’EPCs par rapport à la moyenne basale endothéliale (EBM) ou moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco).
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme mentionné précédemment, adhérent EPCs possèdent une morphologie pavées. Nos multinationales isolés a progressé d’une colonie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades à une colonie de pavées (Figure 2E-2F) sur une période de dix jours de culture. CPE ont été étiquetés différemment par les différents groupes de recherche, à savoir comme fin de cellules progénitrices endothéliales<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous le Grant No. CMMI-1452943 et par le Collège d’honneurs de l’Université de l’Arkansas. Nous tenons également à remercier la Banque de sang de cordon de l’Arkansas pour nous fournir des unités de sang de cordon.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
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