In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana
Summary
Ce manuscrit décrit une in vitro ovule méthode de culture qui permet l’imagerie de cellules vivantes des Arabidopsis zygotes et des embryons. Cette méthode est utilisée pour visualiser la dynamique intracellulaire au cours de la polarisation du zygote et la spécification des cellules sort dans le développement des embryons.
Abstract
Dans la plupart des usines fleurissantes, le zygote et les embryons sont cachés profondément dans les tissus de la mère, et donc il a longtemps été un mystère de comment ils se développent dynamiquement ; par exemple, comment le zygote se polarise à établir l’axe du corps et comment l’embryon spécifie divers destins cellulaires au cours de la formation des organes. Ce manuscrit décrit une méthode in vitro ovule culture pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes du développement des zygotes et des embryons d’Arabidopsis thaliana. Le milieu de culture optimisé permet de zygotes ou jeunes embryons d’évoluer vers des plantes fertiles. En le combinant avec un dispositif de tableau de micropillar de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), l’ovule se tient dans le milieu liquide dans la même position. Cette fixation est cruciale d’observer l’ovule même sous un microscope pour plusieurs jours de la division zygotique à la fin du stade embryonnaire. L’imagerie de cellules vivantes qui en résulte peut être utilisé pour surveiller la dynamique en temps réel de la polarisation du zygote, tels que la migration nucléaire et réarrangement du cytosquelette et aussi le calendrier de la division cellulaire et la spécification sort des cellules au cours de la structuration de l’embryon. En outre, ce système de culture ovule peut être combiné avec des traitements d’inhibiteur pour analyser les effets de divers facteurs sur le développement de l’embryon et avec les manipulations optiques telles que des perturbations de laser d’examiner le rôle de la communication de cellule-cellule.
Introduction
Le plan de base du corps d’un organisme se développe à partir un zygote unicellulaire. Dans la plupart des usines fleurissantes, division zygotique génère une apicale et un baso-cellulaire, qui se développent dans les pousses et des racines, respectivement1. Par conséquent, il est important de comprendre comment le corps de la plante est formé au cours de l’embryogenèse, mais il n’a pas été un outil efficace d’observer directement la dynamique de vie zygotes et des embryons parce qu’ils développent profondément dans la fleur. Chez plusieurs espèces de monocotylédones, telles que le maïs et le riz, une méthode de fécondation in vitro a été établie2,3. Dans cette méthode, isolé des spermatozoïdes et ovules sont soudés électriquement ou chimiquement, et la cellule générée peut évoluer vers une plante fertile. Cependant, chez les plantes dicotylédones, il n’y a aucune méthode de fécondation in vitro qui peut produire des embryons correcte, sans doute en raison de l’état non synchronisé le cycle cellulaire des gamètes mâles et femelles4,5. En outre, le tissu qui entoure l’embryon (endosperme) joue un rôle important dans le développement embryonnaire6.
Dans une espèce de dicotylédones modèle, Arabidopsis, une méthode de culture in vitro a été développée en se concentrant sur l’ovule entier, qui contient l’embryon et l’endosperme7. Ce système a été utilisé avec succès pour analyser les effets de divers réactifs chimiques sur l’embryogenèse, mais il n’est pas adapté pour Time-lapse imagerie parce qu’il a un faible taux de survie. Par conséquent, un système d’élevage de l’ovule roman in vitro a été développé afin de commencer dès le stade du zygote et de produire des plantes fertiles à un ratio élevé8. Après divers essais, on a trouvé ce moyen de Nitsch et tréhalose a considérablement amélioré le taux de survie des ovules8. En outre, parce que l’ovule se développe comme il se développe et donc souvent s’éloigne du champ d’observation du microscope, un dispositif PDMS a été développé pour corriger l’ovule dans la moyenne de9. Le dispositif PDMS a permis l’imagerie à long terme pour les 3-4 jours, qui est suffisant pour suivre le développement d’un zygote à un embryon de coeur-scène. En utilisant cette méthode, il devient possible de visualiser la dynamique de la polarisation du zygote et de l’embryon le patterning, non seulement dans des conditions normales, mais également en présence d’inhibiteurs chimiques ou dans divers milieux mutant8,10 ,11.
Figure 1 : Schéma des marqueurs fluorescents spécifiques permettant de visualiser des Zygotes et des embryons dans l’Ovule.
L’Arabidopsis zygote se développe en embryon dans l’ovule, qui est généré à l’intérieur de la fleur. Dans ce système de culture in vitro , le zygote et les embryons sont observés par le biais de l’ovule, et il est donc important d’utiliser des marqueurs fluorescents spécifiques qui ne sont pas exprimées dans d’autres tissus de l’ovule. Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit présente un simple in vitro ovule culture protocole qui est efficace pour une utilisation dans l’imagerie de cellules vivantes du développement des zygotes et des embryons.
La conception de l’appareil PDMS peut être nécessaire d’optimisation en fonction du stade de l’embryon. Le premier appareil développé était un tableau de microcage pour régler l’orientation et de fixer la position des ovules9, et ensuite un dispositif de microp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microscopie dans ce travail a été menée à l’Institut de transformatrices biomolécules (WPI-ITbM) de l’Université de Nagoya et soutenue par le Japon Advanced Plant Science Network. Ce travail a été soutenu par les bourses de la Japan Science and Technology Agency (projet ERATO T.H. et M.U.) et la société japonaise pour la Promotion de la Science : une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 et JP15H05955 pour M.U. et amendements. JP16H06465, JP16H06464 et JP16K21727 pour T.H), une subvention pour les jeunes scientifiques (B, Nos. JP24770045 et JP26840093 pour M.U.) et une subvention de recherche exploratoire difficiles (no JP16K14753 pour M.U.).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
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