In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana
Summary
Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo’s maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo’s.
Abstract
In de meeste bedektzadigen, de zygote en embryo zijn diep verborgen in het weefsel van de moeder, en dus het is al lang een mysterie van hoe ze de ontwikkeling van dynamisch; bijvoorbeeld, hoe de zygote polariseert de as van het lichaam en hoe het embryo geeft verschillende cel lot tijdens orgel vorming vast te stellen. Dit manuscript een in vitro zaadknop cultuur wordt methode beschreven voor het uitvoeren van live-cel beeldvorming van het ontwikkelen van zygoten en embryo’s van Arabidopsis thaliana. Het medium van de geoptimaliseerde teelt kan zygoten of vroege embryo’s uitgroeien tot vruchtbare planten. Door het te combineren met een poly(dimethylsiloxane) (PDMS) apparaat voor de matrix van de micropillar, wordt de zaadknop gehouden in de vloeistof in dezelfde positie. Deze fixatie is cruciaal voor het observeren van de dezelfde zaadknop onder een Microscoop voor verscheidene dagen vanaf de zygotic divisie tot het late stadium van het embryo. De resulterende beeldvorming van de live-cel kan worden gebruikt om te controleren de real-time dynamiek van zygote polarisatie, zoals nucleaire migratie cytoskelet omlegging, en ook de timing van de celdeling en cel lot specificatie tijdens embryo patronen. Bovendien, deze zaadknop Cultuurstelsel kan worden gecombineerd met remmer behandelingen voor het analyseren van de gevolgen van verschillende factoren op embryo-ontwikkeling, en met optische manipulaties zoals laser verstoring te onderzoeken van de rol van cel-cel communicatie.
Introduction
Het plan van de basis lichaam van een organisme evolueert van een eencellige zygote. In de meeste bedektzadigen, zygotic divisie genereert een apicale en een basale cel, die uitgroeien tot de spruit en wortel, respectievelijk1. Daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe het lichaam van de plant wordt gevormd tijdens de embryogenese, maar er is niet een doeltreffend instrument te observeren direct de dynamiek van levende zygoten en embryo’s, omdat ze de ontwikkeling van diep in de bloem. In verschillende soorten monocot, zoals maïs en rijst, is een in vitro bevruchting methode gevestigde2,3. In deze methode, geïsoleerde zaadcellen en eicellen worden gesmolten elektrisch of chemisch en de gegenereerde cel kan uitgroeien tot een vruchtbare plant. In dicot planten is er echter geen in vitro bevruchting methode die goede embryo’s, vermoedelijk vanwege de niet-gesynchroniseerde celcyclus staat voor mannelijke en vrouwelijke gameten4,5 produceren kan. Daarnaast speelt het embryo-omringende weefsel (endosperm) belangrijke rollen in de embryonale ontwikkeling6.
In een model dicot soorten, A. thaliana, werd een cultivatiemethode in vitro ontwikkeld door te focussen op de hele zaadknop, waarin zowel de embryo en endosperm7. Dit systeem werd met succes gebruikt voor het analyseren van de gevolgen van verschillende chemische reagentia voor embryogenese, maar het is niet geschikt voor time-lapse denkbaar, omdat er een laag overlevingspercentage. Dus, een roman in vitro zaadknop Cultuurstelsel werd ontwikkeld om te beginnen zo vroeg als de zygote fase en produceren van vruchtbare planten op een hoge verhouding8. Na verschillende proeven, bleek dat Nitsch medium en trehalose aanzienlijk verbeterd de overlevingskans van zaadknoppen8. Bovendien, omdat de zaadknop groeit als het groeit en dus vaak uit de buurt van het gebied van de observatie van de Microscoop beweegt, werd een PDMS apparaat ontwikkeld om op te lossen de zaadknop in de middelgrote9. Het PDMS apparaat ingeschakeld de langdurige beeldvorming voor 3-4 dagen, die voldoende is om te traceren van de ontwikkeling van een zygote tot een hart-fase embryo. Met deze methode wordt het mogelijk om te visualiseren van de dynamiek van zygote polarisatie en embryo patronen, niet alleen onder normale omstandigheden, maar ook in de aanwezigheid van chemische inhibitoren of in verschillende mutant achtergronden8,,10 ,11.
Figuur 1: Schematisch Diagram van de specifieke fluorescente markeringen gebruikt om te visualiseren zygoten en embryo’s via de zaadknop.
De Arabidopsis zygote ontwikkelt zich tot een embryo in de zaadknop, die diep in de bloem wordt gegenereerd. De zygote en embryo worden waargenomen door de zaadknop in deze in vitro teelt systeem, en het is dus belangrijk te gebruiken specifieke fluorescente markeringen die niet in andere weefsels zaadknop worden uitgedrukt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript introduceert een eenvoudige in vitro zaadknop teelt protocol dat is efficiënt voor gebruik in de beeldvorming van de live-cel zygoten en embryo’s te ontwikkelen.
Het ontwerp van het PDMS apparaat wellicht optimalisatie volgens de fase embryo. Het eerste ontwikkelde apparaat was een microcage matrix aan te passen de oriëntatie en de positie van de zaadknoppen9vast te stellen, en vervolgens een micropillar apparaat werd gebouwd voor het overvulle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Microscopie in dit werk werd uitgevoerd bij het Instituut van transformatieve Bio-moleculen (WPI-ITbM) van Nagoya University en gesteund door de Japan geavanceerde Plant Science Network. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Japan Science and Technology Agency (ERATO project T.H. en M.U.) en van de Society van Japan voor de promotie van wetenschap: een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 en JP15H05955 voor M.U. en amendementen. JP16H06465, JP16H06464 en JP16K21727 voor th), een Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (B, amendementen. JP24770045 en JP26840093 voor M.U.), en een Grant-in-Aid voor uitdagende verkennend onderzoek (nr. JP16K14753 voor M.U.).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. . Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
