В пробирке Выращивания яйцеклетку для Live клеточной Imaging зигота поляризации и кучность эмбриона в проростках Arabidopsis thaliana
Summary
Эта рукопись описывает в vitro яйцеклетку культивирования метод, который позволяет жить клеточной изображений Arabidopsis зигот и эмбрионов. Этот метод используется для визуализации внутриклеточных динамика во время зигота поляризации и спецификации судьбу клеток в развитии эмбрионов.
Abstract
В большинстве цветковых растений зиготы и эмбриона скрыты глубоко в ткани мать, и таким образом уже давно тайна как они развиваются динамически; к примеру как зиготы поляризовывает установить оси тела и как зародыш указывает различные клетки судьбы во время формирования органа. Эта рукопись описывает в vitro яйцеклетку культуры метод для выполнения клеток изображений развивающихся зигот и эмбрионы Arabidopsis thaliana. Оптимизированный культивирования среднего позволяет зигот или ранних эмбрионов расти в плодородной растения. Объединив его с устройством массив micropillar анонсированный (PDMS), яйцеклетку проводится в жидкой среде в той же позиции. Это закрепление важно соблюдать же яйцеклетку под микроскопом на несколько дней для поздней стадии эмбриона в отделе zygotic. Результирующего изображения клеток может использоваться для мониторинга в реальном времени динамику зигота поляризации, например ядерных миграции и перегруппировки цитоскелета и также сроки деление клеток и спецификации судьбу клеток во время структурирования эмбриона. Кроме того эта система выращивания яйцеклетку может сочетаться с ингибитором лечения для анализа воздействия различных факторов на развитие эмбриона и оптических манипуляции как лазерная срыв для изучения роли связи ячеек.
Introduction
Основной план организм развивается из одноклеточная зигота. В большинстве цветковых растений zygotic Отдел создает апикальной и базально-клеточный, развиться в корень, соответственно1и стрелять. Таким образом важно понять, как завод тела образуется во время эмбриогенеза, но не было эффективным инструментом непосредственно наблюдать динамику жизни зигот и эмбрионов, потому, что они развиваются в глубине цветка. В нескольких видов растения, например кукурузы и риса метод оплодотворение в пробирке был установленным2,3. В этом методе изолированные сперматозоиды и яйцеклетки сплавлены электрически или химически, и созданный клетки могут развиться в плодородной завод. Однако в нелигнифицированного растений, существует не в пробирке оплодотворение метод, который может производить надлежащее эмбрионов, предположительно из-за состояния синхронизированных клеточного цикла мужские и женские гаметы4,5. Кроме того эмбриона окружающих тканей (эндосперм) играет важную роль в развитии эмбриона6.
В модели нелигнифицированного видов, A. thaliana, был разработан метод культивирования в пробирке , сосредоточив внимание на весь яйцеклетку, которая содержит как зародыш, так и эндосперма7. Эта система успешно использовалась для анализа воздействия различных химических реагентов на эмбриогенеза, но это не подходит для покадровой изображений, потому что она имеет низкой выживаемости. Таким образом система выращивания яйцеклетку Роман в vitro была разработана для того, чтобы начать уже в стадии зиготы и производят плодородные растений на высокий коэффициент8. После различных испытаний было установлено, что средний Нитша и Трегалоза значительно улучшить выживаемость семяпочек8. Кроме того потому что яйцеклетку расширяется, как он растет и таким образом часто движется от области наблюдения микроскопа, устройство PDMS был разработан чтобы исправить яйцеклетку в средних9. PDMS устройство включено долгосрочное изображений для 3-4 дня, который является достаточно проследить развитие от зиготы до сердца стадии эмбриона. С помощью этого метода, он становится возможным для визуализации динамики зигота поляризации и эмбриона, кучность, не только при нормальных условиях, но также при наличии химических ингибиторов или в различных мутант стола8,10 ,11.
Рисунок 1: Схема конкретных флуоресцентных маркеров, используются для визуализации зигот и эмбрионы через яйцеклетку.
Arabidopsis зиготы развивается эмбрион в яйцеклетку, который генерируется глубоко внутри цветка. В выращивании этой в пробирке системе зиготы и эмбриона наблюдаются через яйцеклетку, и таким образом важно использовать конкретные флуоресцентные маркеры, которые не выражаются в других тканях яйцеклетку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись представляет простой в vitro яйцеклетку культивирования протокол, который является эффективным для использования в живой клетки изображений развивающихся зигот и эмбрионов.
Дизайн PDMS устройства может потребоваться оптимизация согласно на стадии эмбри?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Микроскопии в этой работе была проведена в Институт трансформативных био-молекул (WPI-ITbM) из Университета Нагоя и поддерживается сеть науки Японии расширенный завод. Эта работа была поддержана грантов от Японии науки и техники Агентство (ERATO проект т.г. и м.ю.) и от японского общества для содействия развитию науки: целевые субсидии для проведения научных исследований в инновационных областях (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 и JP15H05955 м.ю., и Nos. JP16H06465, JP16H06464 и JP16K21727 для T.H), субсидий для молодых ученых (B, Н.у.к. JP24770045 и JP26840093 для м.ю.) и субсидий для сложных поисковых исследований (No. JP16K14753 для м.ю.).
Materials
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. . Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
