Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada
Summary
El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de los compartimentos celulares donde se procesan los antígenos exógenos por degradación retículo endoplasmático asociado en presentación cruzada.
Abstract
Las células dendríticas (DCs) son altamente capaces de procesar y presentar antígenos exógenos internalizados a clase principal de histocompatibilidad (MHC) las moléculas también conocido como Cruz-presentación (CP). CP desempeña un papel importante no sólo en la estimulación de la ingenua CD8+ T memoria CD8 y células+ T las células infecciosas e inmunidad del tumor sino también en la inactivación de automática ingenuo T células por anergia de células T o células T de supresión. Aunque el mecanismo molecular crítico de CP queda por ser aclarada, acumulando indicios que antígenos exógenos se procesan a través del retículo endoplasmático asociado degradación (ERAD) después de su exportación de no clásicas endocíticas compartimientos. Hasta hace poco, las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos fueron limitadas porque no había marcadores moleculares específicos distintos antígenos exógenos. El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de estos compartimentos endocíticos. Usando esta purificado microsoma, hemos reconstituido la ERAD-como transporte, ubiquitinación y procesamiento de los antígenos exógenos en vitro, sugiriendo que el sistema ubiquitina-proteasoma procesado el antígeno exógeno después de la exportación de este compartimiento celular. Este protocolo se puede aplicar más a otros tipos de células para aclarar el mecanismo molecular de CP.
Introduction
El MHC las moléculas se expresan en la superficie de todas las células nucleadas, con cortos péptidos antigénicos derivados de antígenos endógenos, que son procesados por el sistema ubiquitina-proteasoma en el citosol1. Después de procesar, se transportan péptidos antigénicos en el lumen del retículo endoplásmico (ER) por el transportador de péptidos TAP. En el lumen del re, una serie de chaperonas específicas ayudan a la carga del péptido y el plegamiento correcto del MHC I complejo. Esta serie de moléculas se llama el complejo de carga (PLC), que indica que el ER es un compartimiento central para péptido cargando al MHC y2. Después de la carga, de péptidos del MHC las moléculas son transportadas a la superficie de la célula y juega un papel clave en el sistema inmune adaptativo auto marcadores, como permite el CD8+ los linfocitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas o agentes infecciosos por antigénica péptidos de las proteínas del mismo3.
En el antígeno que presenta las células (APC), péptidos antigénicos de los antígenos exógenos son también presentados en MHC4,5,6,7,8 a través de CP, que es fundamentalmente por DCs9,10,11. CP es esencial tanto para la activación de ingenuo CD8+ T memoria CD8 y células+ T células antiinfecciosas y anti-tumoral CTLs12,13y en el mantenimiento de la tolerancia inmune mediante la inactivación de autoactuante ingenuo T células14,15. El CP juega un papel importante muchos en el sistema inmune adaptativo, sin embargo, los mecanismos moleculares de CP tienen todavía ser descrito en detalle. Estudios previos de CP revelaron que antígenos exógenos fueron localizados en el retículo endoplasmático y el endosome y fueron procesados por ERAD, lo que sugiere que los antígenos exógenos son transportados desde el endosome a ER para ERAD-como proceso y péptido carga16 . Sin embargo, evidencia acumulada indica que la carga de péptido de CP se realiza no en la sala de emergencia sino en compartimentos endocíticos no clásica, que también tienen características distintivas de la ER (figura 1)17,18 ,19,20,21. Para evitar la degradación de los precursores del péptido antigénico por la alta actividad de aminopeptidasa22 en el citosol, el procesamiento y el péptido carga en CP se produce en la zona proximal de estos compartimentos endocíticos no clásica (figura 1). Aunque las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos son polémicas, hay no hay moléculas específicas existentes distintos antígenos exógenos en este compartimiento.
ERAD es una vía celular, que elimina específicamente proteínas mal plegadas de la ER. En el camino ERAD, proteínas mal plegadas retrogradely son transportadas a través de la membrana del ER al citoplasma y procesadas por el sistema de ubiquitina-proteasoma23,24,25. Cuando las moléculas grandes, como las proteínas, son transportadas a través de la bicapa lipídica, estas moléculas pasan a través de un aparato molecular llamado un translocon, tales como el complejo Sec61 y Derlin complejo en el ER26y el complejo de Tom y Tim complejo en la las mitocondrias27. Cuando exógeno agregado antígenos son transportados a través de la membrana del ER, que deben penetrar la bicapa lipídica en complejo con translocons, como el complejo Sec61. El método descrito aquí purificada la vesícula específica mediante la utilización de estas moléculas de penetración de la membrana como marcadores para los compartimentos endocíticos.
El método descrito aquí es un nuevo protocolo de purificación de vesícula usando el celular de DC como línea DC2.428 y biotinilado ovoalbúmina (bOVA) como un antígeno exógeno. Los compartimentos endocíticos se purificaron por estreptavidina (SA)-granos magnéticos mediante la penetración de la membrana bOVA como fabricante. En esta purificado microsoma, algunos añaden exógenamente bOVA se conservan en fracciones de membrana pero se transporta al exterior del microsoma y entonces ubiquitinated, procesaron en vitro29. Este microsome purificada contiene proteínas específicas del compartimiento endocíticas, sino también proteínas ER residente para ERAD y el péptido carga compleja; lo que sugiere que el compartimiento celular el compartimiento endocítico prospectivo para CP29. Este protocolo no es dependiente en el tipo de antígenos exógenos y también es aplicable para otros subconjuntos de DC y otros tipos de células, como macrófagos, células B y las células endoteliales, para aclarar el mecanismo molecular exacto de DCs para perito CP.
Protocol
Representative Results
Discussion
En estudios previos de CP, los antígenos exógenos incorporados acumulan en el área restricta del último endosome o ER por microscopía inmunofluorescente16,30,31,32. Se estima que ERAD-como transporte y procesamiento de antígenos exógenos se llevan a cabo en estas áreas especializadas de la ER o último endosome, el compartimento celular fue identificado por sacarosa o iodixanol centrifu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Universidad de Takasaki de la salud y el bienestar.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
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