Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée
Summary
La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification des compartiments cellulaires où les antigènes exogènes sont traitées par dégradation associés au réticulum endoplasmique dans présentation croisée.
Abstract
Les cellules dendritiques (CD) sont très capables de traiter et de présenter des antigènes exogènes intériorisées lors de classe majeur d’histocompatibilité (MHC) j’ai également connu sous le nom de Croix-présentation des molécules (CP). CP joue un rôle important non seulement dans la stimulation de la naïve CD8+ T cellules et mémoire CD8+ T cells pour infectieuses et immunitaires de la tumeur mais aussi dans l’inactivation d’auto-protection cellules naïves T par l’anergie des lymphocytes T ou de la suppression de cellules T. Bien que le mécanisme moléculaire critique du CP reste à élucider, accumulant indiquent que les antigènes exogènes sont traitées par associés au réticulum endoplasmique dégradation (ERAD) après exportation de non-classique endocytose compartiments. Jusqu’à une date récente, la caractérisation de ces compartiments endocytose était limitée car il n’y a aucun marqueurs moléculaires spécifiques autres que les antigènes exogènes. La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification de ces compartiments endocytose. Utilisant cette microsome purifiée, nous avons reconstitué ERAD-comme transport, ubiquitination et traitement de l’antigène exogène in vitro, suggérant que le système ubiquitine-protéasome traitées l’antigène exogène après l’exportation de cette compartiment cellulaire. Ce protocole peut être appliqué également à d’autres types de cellules de clarifier le mécanisme moléculaire de CP.
Introduction
Le MHC I molécules sont exprimées à la surface de toutes les cellules nucléées, avec petits peptides antigéniques provenant des antigènes endogènes, qui sont traitées par le système ubiquitine-protéasome dans le cytosol1. Après le traitement, les peptides antigéniques sont transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique (re) par le transporteur de peptide TAP. Dans la lumière de l’ER, une série de chaperons spécifiques aident le chargement de peptide et le repliement correct de MHC I complexe. Cette série de molécules s’appelle le complexe de peptide-chargement (PLC), indiquant que l’ER est un compartiment central pour le peptide chargement sur MHC I2. Après le peptide de chargement, le MHC I molécules sont transportés à la surface des cellules et jouent un rôle clé dans le système immunitaire adaptatif comme marqueurs autonome et active le CD8+ des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) pour détecter les cellules cancéreuses ou agents infectieux par antigénique peptides de protéines de non-soi3.
En antigène présentant des cellules (APC), des peptides antigéniques des antigènes exogènes sont également présentés à MHC I4,5,6,7,8 par CP, qui est principalement porté par DCs9,10,11. CP est essentiel tant pour l’activation de naïve CD8+ T des cellules et la mémoire CD8+ T cells dans anti-infectieuses et anti-tumorale CTL12,13et dans le maintien de la tolérance immunitaire par l’inactivation du autonomes naïf T cells14,15. Le CP joue plusieurs rôles importants dans le système immunitaire adaptatif, mais n’ont pas encore être décrit en détail les mécanismes moléculaires du CP. Des études antérieures du CP a révélé que les antigènes exogènes ont été localisées dans la salle d’urgence et l’endosome et ont été traitées par ERAD, suggérant que les antigènes exogènes sont transportées de l’endosome à l’urgence pour le traitement de ERAD-like et peptide chargement16 . Toutefois, les preuves s’accumulent indiquent que le chargement de peptide de CP s’effectue pas dans la salle d’urgence, mais plutôt dans des compartiments endocytose non classiques, qui ont aussi des traits distinctifs de l’ER (Figure 1)17,18 ,19,20,21. Pour éviter une dégradation des précurseurs peptide antigénique par la forte activité d’aminopeptidase22 dans le cytosol, le traitement et le peptide dans le CP de chargement se produit dans la zone proximale de ces compartiments endocytose non classique (Figure 1). Bien que la caractérisation de ces compartiments endocytose est controversée, il n’y a aucun existant des molécules spécifiques autres que les antigènes exogènes dans ce compartiment.
ERAD est une voie cellulaire, qui spécifiquement élimine les protéines mal repliées de l’ER. Dans la voie ERAD, les protéines mal repliées sont marqués transportés à travers la membrane du re vers le cytoplasme et traités par l’ubiquitine-protéasome système23,24,25. Lorsque les grosses molécules, comme les protéines, sont transportés à travers la bicouche lipidique, ces molécules traversent un dispositif moléculaire appelé un translocon, tels que le complexe Sec61 et Derlin complexe dans l’ER26et le complexe de Tom et Tim complexe dans la 27de mitochondries. Lorsque les antigènes exogènes ajoutés sont transportés à travers la membrane du re, ils doivent pénétrer la bicouche lipidique complexe avec translocons, tels que le complexe Sec61. La méthode décrite ici a purifié la vésicule ciblée en utilisant ces molécules pénétrantes membrane comme marqueurs pour les compartiments de l’endocytose.
La méthode décrite ici est un nouveau protocole de purification de vésicule à l’aide de la cellule DC ligne DC2.428 et biotinylés ovalbumine (bOVA) comme un antigène exogène. L’endocytose compartiments ont été purifiés par la Streptavidine (SA)-des billes magnétiques utilisant le bOVA pénétrantes membrane comme un fabricant. Dans cette microsome purifiée, certains ajoutée exogène bOVA était encore conservé dans les fractions membranaires mais ont été transporté à l’extérieur des microsomes et puis ubiquitinées et traitée en vitro29. Cette microsome purifiée contenait non seulement les protéines intervenant dans l’endocytose de compartiment spécifiques, mais aussi les protéines ER-résident pour ERAD et le peptide de chargement complexe ; ce qui laisse supposer que le compartiment cellulaire est le compartiment endocytose prospectif pour CP29. Ce protocole n’est pas tributaire de la nature des antigènes exogènes et s’applique également pour les autres sous-ensembles de DC et autres types de cellules, telles que les macrophages, les cellules B et les cellules endothéliales, de clarifier le mécanisme moléculaire précis de DCs pour CP compétent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les études précédentes du CP, les antigènes exogènes incorporés accumulent dans la zone réglementée de l’endosome tardif ou ER par microscopie par immunofluorescence16,30,31,32. On estime que ERAD-comme transport et le traitement des antigènes exogènes sont effectués dans ces domaines spécialisés de l’ER ou retard endosome, le compartiment cellulaire a été identifié par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par la Takasaki Université de la santé et le bien-être.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
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